الحصول على مزرعة الخلايا الدبقية المختلطة من دماغ الفأر حديثي الولادة

الملخص

المصدر: Sarkar، S. et al.، العزل المغناطيسي السريع والمكرر CD11b للخلايا الدبقية الصغيرة الأولية مع تحسين النقاء والتنوع. J. Vis. Exp. (2017)

أظهر الفيديو طريقة عزل الخلايا وزراعتها من دماغ الفأر حديثي الولادة. تضمنت التفكك الأنزيمي والميكانيكي للدماغ ، يليه الزراعة في وسط النمو الذي يفتقر إلى عامل النمو العصبي للحصول على مجموعة دبقية مختلطة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< p class = "jove_title" >1. زراعة الثقافات الدبقية المختلطة

1. اقطع رأس الجراء البالغة من العمر 1 إلى يومين بسرعة باستخدام مقص تشغيل 5.5 بوصة وضع الرؤوس على الفور في أنبوب سعة 50 مل على الجليد. لاحظ أن قطع الرأس هذا هو طريقة القتل الرحيم.
2. في غطاء تدفق الهواء الرقائقي ، قم بعمل شق صغير في الجمجمة والسحايا باستخدام مقص تشريح دقيق مستقيم مقاس 4.5 بوصة. ابدأ في القطع من الطرف الذيلي إلى الطرف المنقاري (الأنف). ادخل تحت الجلد باستخدام الفتحة التي شكلها قطع الرأس.
   1. بعد الشق ، قشر أحد نصفي الكرة الأرضية إلى الجانب. ثم استخدم زوجا من الملقط المنحني أو المعقوف لإزالة الدماغ بالكامل.
3. اغمر الدماغ (الدماغ) في أنبوب جديد سعة 50 مل يحتوي على 0.25٪ حمض التربسين - إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) لمدة 15 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية. استخدم 2 مل من التربسين EDTA لكل دماغ.
4. اغسل الدماغ (الدماغ) بوسائط نمو جديدة (10٪ مصل بقري جنين (FBS) ، خليط النسر المعدل / المغذيات F12 (DMEM / F12) ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، 1٪ ل-جلوتامين ، 1٪ بيروفات الصوديوم ، و 1٪ أحماض أمينية غير أساسية) عن طريق إضافة الوسائط وإزالتها. كرر هذا 4x.
5. لكل دماغ ، ضع قارورتين من T-75 تحتوي على وسائط النمو. لذلك ، أضف 2 مل من وسائط النمو لكل دماغ إلى الأنبوب. وبالتالي ، سيكون ما يعادل 1 مل من الدماغ المتجانس مع 8-9 مل من وسائط النمو لكل قارورة T-75.
6. تجانس عن طريق خلية الدماغ (الدماغ) بماصات ذات أحجام مختلفة من الفتحات، بالترتيب من الأكبر إلى الأصغر. عندما يكون من الواضح أن أنسجة المخ لا تصبح أصغر ، انتقل إلى الماصة التالية. في نهاية المحاكمة ، يجب أن يكون التعليق واضحا ، مع عدم وجود أجزاء مرئية.
   1. استخدم ماصة سعة 25 مل وماصة سعة 5 مل ثم ماصة سعة 10 مل بالتتابع.
7. مرر كل معلق دماغي متجانس من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر لتحويلها إلى مزرعة خلية واحدة.
8. لكل دماغ متجانس ، ضع قارورتين من T-75 تحتوي على وسائط نمو ، كما هو موضح في الخطوة 1.5 (1 مل من الدماغ المتجانس مع 8-9 مل من وسائط النمو لكل قارورة T-75).
9. قم بتغيير وسائط النمو بعد 6 أيام وتنمو حتى العزلة في اليوم 16.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM/F12 (1:1) (1x) تقنيات الحياة 11330057 بيروفات الصوديوم تقنيات الحياة 11360070 الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100x) تقنيات الحياة 11140050 L-جلوتامين (100x) تقنيات الحياة 25030081 EDTA فيشر ساينتيك AM9260G مصل الأبقار الجنينية سيغما 13H469 0.25٪ تريبسين EDTA جيبكو من لايف تكنولوجيز 25200