مقالة منهجية

تمييز الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان إلى خلايا شبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Funes، S. et al. ، الخلايا الشبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة البشرية: التمايز من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ومقايسة البلعمة ذات الخلايا الحية في المختبر باستخدام المشابك البشرية.J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو إجراء تمايز الخلايا البشرية متعددة القدرات إلى خلايا شبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة. تتضمن العملية تكوين أجسام جنينية ، ونقلها إلى آبار مغلفة ، واستخدام عوامل نمو محددة لتوجيه التمايز إلى سلائف البلاعم البدائية ، والتي تتمايز أخيرا إلى خلايا شبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة

ملاحظة: يتم تلخيص نظرة عامة على البروتوكول في الشكل 1.

  1. ثقافة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC)
    ملاحظه: يمكن العثور على مزيد من التفاصيل التي تصف تقنيات ثقافة iPSC في مكان آخر.
    1. الذوبان والصيانة
      1. تحضير وسيط iPSC, aliquot منه, وتخزينه في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. قم بإذابة الكميات طوال الليل عند 4 درجات مئوية واستخدمها لمدة تصل إلى أسبوع واحد. اترك الوسائط في درجة الحرارة المحيطة لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل الاستخدام.
      2. قم بتغطية آبار صفيحة مكونة من 6 آبار بإضافة 1 مل من 10 ميكروغرام / مل من اللامينين 521 المخفف في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم. احتفظ بالأطباق في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة ساعتين على الأقل أو يفضل بين عشية وضحاها. بمجرد تخفيفه ، قم بتخزين اللامينين على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 3 أشهر.
      3. قم بإعداد محلول مخزون مثبط Rho kinase Y27632 (ROCK Inhibitor) بسعة 10 ملي مولار عن طريق التخفيف في ماء معقم. قم بعمل كميات تستخدم مرة واحدة من محلول مثبط ROCK وتخزينها عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
      4. تحضير 0.5 ملي مولار حمض رباعي الأسيتيك إيثيلين ديامين (EDTA) عن طريق تخفيف محلول المخزون 0.5 M EDTA في DPBS.
      5. لإذابة قارورة iPSCs المجمدة, ضع القارورة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية حتى يتم إذابة معظمها. نقل محتوى القارورة على الفور إلى 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على 4 مل من iPSC متوسط. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 1 دقيقة.
      6. شفط طافي وإعادة تعليق الخلايا بإضافة ببطء 1 مل من وسيط iPSC يحتوي على 10 ميكرومتر ROCK مثبط ضد جدار الأنبوب لتجنب إزعاج المستعمرات.
      7. أضف 1.5 مل من وسيط iPSC يحتوي على 10 ميكرومتر مثبط ROCK لكل من الآبار المطلية ونقل المستعمرات المعلقة قطرة قطرة إلى الآبار التي تحتوي على الوسط.
        ملاحظه: استخدم 5-7 قطرات من الخطوة 1.1.1.6 لصيانة الاستزراع ولكن اضبط كثافة البذر المثلى لكل خط iPSC.
      8. قم بتوزيع الخلايا بالتساوي في الآبار عن طريق خلط اللوحة يدويا من جانب إلى آخر ومن الخلف إلى الأمام. ضع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. في اليوم التالي, استبدال الوسط تماما بإضافة وسيط iPSC جديد دون مثبط الصخور.
      9. للصيانة ، قم بتغيير الوسط كل يوم حتى تصل الخلايا إلى 80٪ من التقاء.
        ملاحظه: يمكن الحفاظ على الخلايا دون تغيير الوسط 2 أيام إذا كان وسيط iPSC المستخدم يسمح بجدول تغذية مرن. ينصح بقصر هذا على مرة واحدة لكل مقطع وفقط إذا كانت الخلايا أقل من 50٪ ملتقية.
    2. تقسيم
      1. استنشق الوسط واغسل الخلايا ب 1 مل من DPBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم).
      2. لإخراج الخلايا ، أضف 1 مل من 0.5 ملي مولار EDTA واحتضانها لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة حتى ترتفع حواف مستعمرات الخلية من سطح البئر. اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام DPBS وأضف 1 مل من وسيط iPSC.
      3. قم بفصل مستعمرات الخلايا عن طريق كشطها برفق باستخدام رافع الخلايا. اكشط كل منطقة من البئر مرة واحدة فقط لتجنب إزعاج المستعمرات.
        ملاحظه: يمكن العثور على طرق بديلة لطرد المستعمرات من البئر في مكان آخر.
      4. باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل، اجمع الخلايا وانقلها قطرة قطرة بنسبة 1:6 (الخلايا إلى المتوسطة) إلى آبار مطلية مسبقا (كما هو مذكور في الخطوة 1.1.1.2) تحتوي على 1.5 مل من وسط iPSC.
فئة < ص = "jove_title" >2. تمايز iPSC إلى الخلايا الشبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة (iMGs)

ملاحظة: يتم إذابة الجزيئات الصغيرة وعوامل النمو في ألبومين مصل الأبقار المعقم بنسبة 0.1٪ في DPBS إلى تركيز مخزون أعلى بمقدار 1,000 مرة من التركيز النهائي. من المستحسن أن يميز iPSCs إلى iMGs خلال الممرات المبكرة. ينصح بالتنميط النووي الروتيني لخطوط iPSC.

  1. تحضير محلول الطلاء القياسي
    1. قم بإذابة محلول مخزون كاشف طلاء المصفوفة خارج الخلية على الجليد عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    2. أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وأطراف ماصة الترشيح مسبقا عند 4 درجات مئوية.
    3. Aliquot 250 ميكرولتر من كاشف طلاء المصفوفة خارج الخلية المركز في كل أنبوب وضعه على الفور على الجليد. قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية.
    4. لتحضير محلول الطلاء ، قم بإذابة أحد كاشف طلاء المصفوفة خارج الخلية على الجليد عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    5. أضف 50 مل من خليط النسر المعدل / المغذيات F12 (DMEM-F12) المحسن لنمو الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والمستحثة متعددة القدرات (يشار إليها باسم DMEM-F12) إلى أنبوب مخروطي مبرد مسبقا واحتفظ به على الجليد.
    6. قم بتبريد طرف ماصة سعة 1 مل عن طريق سحب ماصة DMEM-F12 المثلج لأعلى ولأسفل عدة مرات، ثم استخدم طرف الماصة على الفور لنقل 250 ميكرولتر من كاشف طلاء المصفوفة خارج الخلية إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على وسط DMEM-F12. < / > ملاحظه: يمكن تخزين محلول الطلاء القياسي لمدة أسبوعين عند 4 درجات مئوية.
  2. تكوين الجسم الجنيني (EB)
    1. تحضير وسط EB يمكن الحفاظ عليه عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام.
    2. بمجرد أن تصل iPSCs إلى 80٪ التقاء, تفكيك المستعمرات عن طريق الغسيل مع 1 مل من DPBS وإضافة 1 مل من كاشف التفكك 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اجمع الخلايا وانقل كل شيء إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 9 مل من DPBS.
    3. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة دقيقة واحدة ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط EB. خذ 10 ميكرولتر من الخلايا وخفف 1: 1 باستخدام Trypan blue. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم، وبناء على عدد الخلايا، قم بتخفيف مخزون الخلية إلى تخفيف نهائي يبلغ 10,000 خلية لكل 100 ميكرولتر. بالنسبة لخلايا الطلاء ، أضف 100 ميكرولتر من الخلايا المخففة لكل بئر إلى صفيحة منخفضة الالتصاق ، ذات قاع دائري ، 96 ><بئر. ملاحظه: عموما, 48 يمكن الحصول على آبار من لوحة 96 بئر من كل 80٪ بئر ملتقى من iPSCs.
    4. قم بالطرد المركزي للوحة عند 125 × جم لمدة 3 دقائق واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 4 أيام. قم بإجراء تغيير نصف متوسط في اليوم 2 باستخدام ماصة متعددة القنوات وجمع 50 ميكرولتر من الوسط القديم برفق، ثم إضافة 50 ميكرولتر من وسط EB الطازج.
      ملاحظه: في اليوم 4, ستشكل iPSCs هياكل خلوية كروية تسمى EBs كما هو موضح في قسم النتائج. يمكن تمديد عملية تمايز EB حتى 7 أيام ، إذا لزم الأمر.
  3. توليد سلائف البلاعم البدائية (PMPs)
    1. قم بإعداد متوسط قاعدة PMP ، مرشح معقم ، وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
    2. قم بتغطية آبار الصفيحة المكونة من 6 آبار عن طريق إضافة 1 مل من محلول طلاء Matrigel المثلج واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة ساعتين على الأقل أو يفضل بين عشية وضحاها.
    3. في اليوم 4 من تمايز EB ، انقل EBs إلى الآبار المطلية ب Matrigel عن طريق تجميع EBs بأطراف ماصة 1 مل (باستخدام ماصة). الماصة لأعلى ولأسفل مرة أو مرتين لإخراج EBs من البئر. أمسك اللوحة المكونة من 6 آبار بزاوية مائلة للسماح ل EBs بالاستقرار على حافة البئر. < / > ملاحظه: يمكن طلاء تسعة أو عشرة EBs لكل بئر مطلي.
    4. بمجرد أن تستقر جميع EBs، قم بإزالة الوسط القديم برفق باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل مع إبقاء EBs على حافة البئر. أضف 3 مل من PMP المتوسط الكامل المحضر حديثا إلى كل بئر. قم بتوزيع الخلايا بالتساوي في الآبار عن طريق خلط اللوحة يدويا من جانب إلى آخر ومن الخلف إلى الأمام. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    5. لا تزعج اللوحة لمدة 7 أيام للسماح ل EBs بالالتصاق بقاع البئر. بعد ذلك الوقت ، قم بإجراء تغيير نصف متوسط باستخدام وسيط PMP الكامل.
      ملاحظه: في هذه المرحلة ، يجب إرفاق معظم EBs باللوحة. يمكن إزالة أي EBs عائمة.
    6. بعد 5-7 أيام ، افحص EBs تحت مجهر مجال الضوء بتكبير 4x للتأكد من أنها متصلة بقاع الآبار. قم بتغيير الوسيط كما هو موضح في 1.2.3.5. في اليوم 21 ، قم بإجراء تغيير متوسط كامل باستخدام 3 مل من PMP المتوسط الكامل.
      ملاحظه: قد تكون أسلاف النخاع العائمة في الوسط واضحة في هذه المرحلة. يجب التخلص من هذه الخلايا أثناء التغيير المتوسط.
    7. في اليوم 28 ، ابحث عن الخلايا المستديرة التي يشار إليها باسم PMPs في المادة الطافية واجمع الوسط الذي يحتوي على PMPs باستخدام ماصة سعة 10 مل وماصة أوتوماتيكية. احرص على عدم إزعاج EBs. انقل PMPs والوسيط إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وتابع كما هو موضح في الخطوة 1.2.4. < / > ملاحظه: عادة ما يمكن جمع PMPs من نفس خط iPSC من خمسة آبار من لوحة 6 آبار وتجميعها معا في أنبوب مخروطي واحد 15 مل.
    8. أضف 3 مل من وسط PMP الكامل الطازج لمزيد من الصيانة ل EBs. نظرا لأن PMPs تخرج باستمرار من EBs لأكثر من 3 أشهر ، فقم بجمعها كل 4-7 أيام (لا تسمح للوسيط بتغيير اللون إلى اللون الأصفر) كما هو موضح في الخطوتين 1.2.3.7 و 1.2.3.8.
      ملاحظه: على الرغم من أنه يمكن جمع PMPs لعدة أشهر ، إلا أنها قد تغير نمطها الظاهري بمرور الوقت.
  4. التمايز إلى iMGs
    1. قم بإعداد وسط قاعدة iMG (جدول المواد) ، وفلتر معقم وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.
    2. بمجرد جمع PMPs في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، قم بطردها بجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم عن طريق أخذ كمية صغيرة وتخفيف 1: 1 باستخدام Trypan blue.
      ملاحظة: 0.5-1.5 × 106 يتم الحصول على PMPs عادة كل أسبوع اعتمادا على خط iPSC وعمر ثقافة EB.
    3. الطرد المركزي لبقية الخلايا مرة أخرى عند 200 × جم لمدة 4 دقائق. قم بإجراء تغيير نصف متوسط باستخدام وسيط iMG الكامل المحضر حديثا كل 3-4 أيام على مدار 10-12 يوما للسماح بالتمايز النهائي.
      ملاحظه: في هذه المرحلة ، يجب أن تكتسب الخلايا مورفولوجيا شبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة. لتأكيد التزام PMPs بمصير الخلايا الدبقية الصغيرة ، يتم إجراء تحليل التألق المناعي لتأكيد التعبير عن العلامات المخصبة بالخلايا الدبقية الصغيرة مثل مستقبلات البيورينرجيك P2RY12 والبروتين الغشائي 119 (TMEM119).
    4. للحفاظ على صحة الخلية وقابليتها للحياة ، قم بإجراء جميع التجارب بين الأيام 10 إلى 12 من تمايز iMG.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: تخطيطي للبروتوكول لتمييز iPSCs إلى خلايا شبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة.في اليوم 0, بمجرد أن وصلت iPSCs إلى 80٪ التقاء, يتم تفكيك المستعمرات إلى خلايا مفردة وزراعتها في وسط EB للحث على تكوين EB. في اليوم 4 ، يتم جمع EBs وطلاءها في وسط PMP للحث على توليد PMP. بعد 28 يوما ، يتم جمع PMPs وتمييزها نهائيا إلى iMGs باستخدام وسيط iMG. يمكن جمع PMPs أسبوعيا لمدة تصل إلى 3 أشهر. الاختصا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مواد زراعة الخلايا 6 أطباق جيدة غرينر بيو ون 657160 100 مم × 20 مم معالجة زراعة الأنسجة سيلتريت هاتف: 229620 رافع الخلية، طرف مزدوج، شفرة مسطحة وشفرة ضيقة، معقمة سيلتريت 229305 لوحة منخفضة الالتصاق مستديرة القاع 96 بئر كورنينج 7007 Primaria 24 بئر سطح مسطح القاع تعديل لوحة ثقافة الخلايا متعددة الآبار كورنينج 353847، Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate كورنينج 353846 بريماريا 96 بئر شفاف مسطح القاع كورنينج 353872 كواشف تفكك الخلايا أكوتاز كورنينج هاتف: 25058CI كواشف التفكك المستخدمة لتمايز الخلايا العصبية الحركية السفلية كاشف TrypLE تقنيات الحياة 12-605-010 كواشف التفكك المستخدمة في تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة UltraPure 0.5 M EDTA، درجة الحموضة 8.0 إنفيتروجين 15575020 كواشف الطلاء لزراعة الخلايا ماتريجل GFR مصفوفة غشاء كورنينج™ 354230 يشار إليه باسم كاشف طلاء المصفوفة خارج الخلية سيل لامينين 521 تقنية STEMCELL 77004 يشار إليه باسم laminin 521 بولي د-يسين سيغما ص 7405 إعادة التكوين إلى 0.1 مجم / مل في محلول البورات بولي إل أورنيثين سيغما ص 3655 إعادة التكوين إلى 1 مجم / مل في محلول البورات مكونات وسائط iPSC طقم mTeSR Plus تقنية STEMCELL 100-0276 لإعداد وسائط iPSC ، قم بخلط المكونات إلى 1x مكونات وسائط EB BMP-4 فيشر ساينتيك PHC9534 التركيز النهائي 50 نانوغرام / مل وسائط iPSC التركيز النهائي 1x مثبط الصخور Y27632 فيشر ساينتيك 562822 دينار بحريني التركيز النهائي 10 ميكرومتر SCF بيبروتك 300-07 التركيز النهائي 20 نانوغرام / مل فيجف بيبروتك 100-20 أ التركيز النهائي 50 نانوغرام / مل مكونات وسائط PMP الأساسية جلوتاماكس جيبكو 35050061 التركيز النهائي 1x البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) جيبكو 15140122 التركيز النهائي 100 وحدة / مل إكس فيفو 15 لونزا 12001-988 التركيز النهائي 1x مكونات وسائط PMP الكاملة 55 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول جيبكو 21985023 التركيز النهائي 55 ميكرومتر IL-3 بيبروتك 200-03 التركيز النهائي 25 نانوغرام / مل M-CSF بيبروتك 300-25 التركيز النهائي 100 نانوغرام / مل وسائط PMP الأساسية التركيز النهائي 1x مكونات وسائط iMG الأساسية DMEM / F12 المتقدم جيبكو 12634010 التركيز النهائي 1x جلوتاماكس جيبكو 35050061 التركيز النهائي 1x مكمل N2 ، 100x جيبكو 17502-048 التركيز النهائي 1x البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) جيبكو 15140122 التركيز النهائي 100 وحدة / مل مكونات وسائط iMG الكاملة 55 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول جيبكو 21985023 التركيز النهائي 55 ميكرومتر IL-34 PeproTech أو Biologend 200-34 أو 577904 التركيز النهائي 100 نانوغرام / مل وسائط iMG الأساسية التركيز النهائي 1x M-CSF بيبروتك 300-25 التركيز النهائي 5 نانوغرام / مل TGF-β بيبروتك 100-21 التركيز النهائي 50 نانوغرام / مل مكونات وسائط قاعدة الحث DMEM/F12 مع HEPES جيبكو 11330032 التركيز النهائي 1x جلوتاماكس جيبكو 35050061 التركيز النهائي 1x مكمل N2 ، 100x جيبكو 17502-048 التركيز النهائي 1x الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ، 100x جيبكو 11140050 التركيز النهائي 1x مكونات وسائط الحث الكاملة المجمع E كالبيوكيم 565790 التركيز النهائي 0.2 ميكرومتر وإعادة تكوين كاشف المخزون إلى 2 ملي مولار في الإيثانول 1: 1 و DMSO الدوكسيسيكلين سيغما د9891 التركيز النهائي 2 ميكروغرام / مل وإعادة تكوين كاشف المخزون إلى 2 مجم / مل في DPBS وسائط قاعدة الحث التركيز النهائي 1x مثبط الصخور Y27632 فيشر ساينتيك 562822 دينار بحريني التركيز النهائي 10 ميكرومتر كواشف زراعة الخلايا الأخرى تريبان بلو ، محلول 0.4٪ شركة أميرسكو K940-100 مل ألبومين مصل الأبقار (BSA) سيغما هاتف: 22144-77-0 DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم كورنينج 21-030-السيرة الذاتية DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم كورنينج 21-031-السيرة الذاتية يشار إليها باسم DPBS خروج المغلوب DMEM / F-12 جيبكو 12660012 يشار إليه باسم DMEM-F12 الأمثل لنمو الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والمستحثة متعددة القدرات بروتين الفأر اللامينين، طبيعي جيبكو 23017015 يشار إليه باسم laminin

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة