إخلاء المسؤولية: تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
< p class = "jove_title" >
1. تفكك شبكية العين
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات التالية (حتى حصاد الخلايا) في خزانة السلامة الحيوية A2 أو B2 (BSC).
- تحضير خليط تفكك Papain / DNase I على النحو التالي.
- بالنسبة لستة شبكية العين ، أضف 75 ميكرولتر من DNase I في الأنبوب الذي يحتوي على 750 ميكرولتر من غراء واخلطه بعناية (خليط التفكك).
- لتحضير العينة الفردية المطلوبة لهذا البروتوكول ، قسم الحجم الإجمالي البالغ 825 ميكرولتر إلى ثلاثة حصص: 275 ميكرولتر من الخليط في أنبوب واحد سعة 1.5 مل لكل فأر (شبكية العين). احسب الكميات المطلوبة من DNase I و Papain وفقا لذلك.
ملاحظه: يمكن فصل ما يصل إلى ستة شبكية العين في أنبوب واحد من خليط غراء / DNase I. ومع ذلك ، فإن تحضير العينة الفردية ينتج عنه عدد أقل من الكتل ونمو الخلايا بشكل أفضل من العينات المجمعة.
- انقل شبكية العين إلى خليط تفكك Papain / DNase I. استخدم ماصة نقل بقطر طرف مكبر ، والتقط شبكية العين ، وانتظر حتى تستقر شبكية العين في الجزء السفلي من الطرف ، ثم حرر شبكية العين بدون محلول ملح هانكس المتوازن (HBSS) في الأنبوب الذي يحتوي على خليط غراء / DNase I.
- ضعه على المغذي واحتضنه لمدة 10 دقائق في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2).
- قم بفصل الخلايا عن طريق سحب العينة بعناية لأعلى ولأسفل (حوالي 20-30 مرة) باستخدام ماصة سعة 1 مل. بعد تفكك الخلايا (أي ينتج عنه محلول متجانس بدون قطع) ، أضف 275 ميكرولتر من مثبط بروتياز Ovomucoid من مجموعة تفكك غراء لتحييد غراء. تخلط بلطف عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. ملاحظة: إذا تم فصل ستة شبكية العين في 825 ميكرولتر من خليط غراء / DNase I ، فستكون هناك حاجة إلى 825 ميكرولتر من Ovomucoid.
- الطرد المركزي الخليط على حرارة 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- أضف عامل نمو البشرة (EGF ، 1 ميكرولتر لكل 1 مل من وسط النمو ، معاد تكوينه عند 200 ميكروغرام / مل في PBS) إلى الحجم المحسوب لوسط النمو (1 مل لكل فأر) الدافئ مسبقا عند 37 درجة مئوية < br / >
ملاحظة: اعتمادا على التصميم التجريبي ، يمكن إضافة علامة التكاثر 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ، بالإضافة إلى 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) أو العوامل الأخرى المطلوبة في بداية فترة الاستزراع.
- قم بإزالة الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي. لا تلمس الحبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب.
- قم بإزالة المادة الطافية بعناية وبالكامل. أعد تعليق حبيبات الخلية ب 500 ميكرولتر من وسط النمو المكملة ب EGF.
- انقل تعليق الخلية إلى بئر واحد من اللوحة ذات 12 البئرة المسمى (الشكل 1 ج). اشطف الأنبوب ب 500 ميكرولتر أخرى من وسط النمو المكملة ب EGF وأضفه إلى البئر (الحجم الإجمالي 1 مل لكل بئر).
- كرر الخطوتين 1.8 و1.9 مع جميع العينات الأخرى.
- هز صفيحة البئر ثلاث مرات بعناية (ذهابا وإيابا ؛ يسارا ويمينا). ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجة مئوية ، ثاني أكسيدالكربون 2).
ملاحظه: إذا تم استخدام الفئران المعدلة وراثيا ، فقم بإجراء التنميط الجيني لكل (الشكل 1 د). حدد Cre إعادة تركيب الفئران الإيجابية والسالبة وقم بتسمية اللوحة وفقا لذلك. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم استخدام خلايا الفئران المراسلة الإيجابية Cre لإعادة التركيب فقط للخطوات التالية. يتم تجميد خلايا العينات السلبية Cre واستخدامها في تطبيقات أخرى.
< p class = "jove_title" >
2. مرحلة النمو
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: تستغرق مرحلة النمو حوالي 4-5 أيام (
الشكل 2 ب). لإضافة السوائل إلى الآبار التي تحتوي على خلايا ، يجب أن تشير الماصة إلى جدار البئر ويجب إطلاق السائل ببطء لتجنب انفصال الخلية. لا تضع الماصة مباشرة فوق الخلايا.
- بعد يوم واحد من التفكك ، قم بإزالة الوسط وأضف 1 مل من وسط النمو الطازج المكممل ب EGF.
- في اليوم 3 ، قم بإزالة الوسط وأضف 1 مل من HBSS (درجة حرارة الغرفة) لإزالة بقايا الخلايا. صخور برفق ذهابا وإيابا من اليسار إلى اليمين. قم بإزالة HBSS ، وكرر خطوة الغسيل ، وأضف 1 مل من وسط النمو المكمل ب EGF الدافئ مسبقا.
- راقب الخلايا كل يوم وقم بتقييم حالة نموها حتى تصل الخلايا إلى 90٪ -100٪ من التقاء. يوضح الشكل 3 مثالا على النمو الجيد ل MG بمرور الوقت. تحقق من احتمال حدوث تلوث أو موت الخلايا. تخلص من الثقافات الملوثة.
ملاحظه: لمراقبة حالة الخلية وتسجيلها، التقط صورا بتكبيرات مختلفة باستخدام مجهر ضوئي مزود بكاميرا مرفقة وأهداف 4x أو 10x أو 20x. في هذه الدراسة ، يتم استخدام المجهر الفلوري.
< p class = "jove_title" >
3. تحضير الغطاء مع بولي إل أورنيثين (بولي أو) ومعطف لامينين
ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية فقط إذا تم إجراء وضع العلامات على الفلورسنت المناعي والفحص المجهري للمسح بالليزر متحد البؤر. الأغطية الزجاجية المستديرة (قطرها 12 مم) مطلوبة للتصوير المناسب. يمكن أيضا العثور على بروتوكول الطلاء في ورقة بيانات الوسط العصبي (انظر جدول المواد).
- ضع أغطية معقمة بعناية في وسط كل بئر من صفيحة 24 بئرا باستخدام ملقط #2AP دومون المعقم.
ملاحظه: ضع أغطية في وسط البئر. سيؤدي وضع أغطية بالقرب من جدار البئر إلى حدوث مشكلات في التوتر السطحي للخطوات التالية.
- قم بإذابة 2.5 مل من Poly-O في درجة حرارة الغرفة وضع 100 ميكرولتر منه في وسط كل غطاء.
- احتضن لوحة البئر لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية.
- قم بإزالة Poly-O واغسل البئر بالغطاء ثلاث مرات ب ~ 1 مل من الماء المعقم.
- دع طبق البئر يجف طوال الليل في BSC. قم بإذابة 2.5 مل من Laminin عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
- في صباح اليوم التالي ، أضف 100 ميكرولتر من Laminin في وسط كل غطاء واحتضنه لمدة 4 ساعات في حاضنة 37 درجة مئوية.
- قم بإزالة اللامينين بعناية وبالكامل.
- احتفظ باللوحة عند 4 درجات مئوية إذا تعذر إجراء المرور على الفور.
ملاحظه: يمكن الاحتفاظ بالغطاء المطلي في الألواح المحضرة لبضعة أيام عند 4 درجات مئوية.
< p class = "jove_title" >
4. مرور الخلية لإزالة الناجين من الخلايا العصبية
ملاحظة: يلزم مرور الخلية لإزالة الخلايا العصبية ، وليس لزيادة عدد الخلايا. تنقسم الدبقية عدة مرات فقط ولن تنمو أكثر بعد المرور. لا تخفف معلقات الخلايا. يمكن توزيع خلايا بئر واحد ملتقى من صفيحة مكونة من 12 بئرا على بئر واحد من صفيحة 12 بئرا أو بئرين من صفيحة 24 بئرا. عند استخدام أغطية الغطاء المطلية ، يتم طلاء حوالي ثلث الغطاء فقط. لذلك ، يمكن الحصول على ستة أغطية تجلس في صفيحة من 24 بئرا ، مع خلايا ملتصقة (~ 80٪ -90٪) من بئر واحد من الخلايا المتقاربة لصفيحة مكونة من 12 بئرا. يمكن اختيار نسب أخرى لزيادة أو تقليل كثافة الخلايا أيضا. بالنسبة لهذا البروتوكول ، يتم استخدام فأر مراسل Cre + واحد [تجربة واحدة ، علاجان: miR-25 أو control-miR ؛ التكرارات الفنية n = 3 (ثلاث أغطية لكل معالجة) ، النسخ المتماثل البيولوجي n = 1]. يمكن تعريف عدد التكرارات التقنية والبيولوجية بشكل مختلف اعتمادا على التصميم التجريبي.
- تحقق مما إذا كانت الخلايا ملتقية بنسبة 90٪ -100٪ (أيضا على هامش البئر ؛ الشكل 3E ، F).
- قم بإزالة الوسط وأضف 1 مل من HBSS (درجة حرارة الغرفة) لغسلها. هز اللوحة برفق (ذهابا وإيابا ، يسارا ويمينا). قم بإزالة HBSS تماما.
- أضف 500 ميكرولتر من محلول يحتوي على التربسين الدافئ مسبقا (تم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية في حمام حبة معدنية) لفصل الخلايا عن البئر. صخور برفق (ذهابا وإيابا ، من اليسار إلى اليمين) واحتضن لمدة دقيقتين في حاضنة 37 درجة مئوية.
- انقل اللوحة من الحاضنة إلى BSC. أثناء الإمالة ، قم بشفط المحلول المحتوي على التربسين ووزعه بعناية وببطء فوق البئر عدة مرات حتى تنفصل الخلايا تماما. أمسك اللوحة بالضوء وتأكد من عدم ترك أي خلايا في الأسفل.
- انقل معلق الخلية هذا إلى أنبوب معقم سعة 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية بعناية عن طريق إضافة 600 ميكرولتر (100 ميكرولتر لكل بئر ل 6 آبار / أغطية) من وسط النمو الدافئ مسبقا (مكمل ب EGF ؛ 1: 1000). والماصة لأعلى ولأسفل ~ 30-40 مرة.
ملاحظه: يمكن تجميد الخلايا في هذا الوقت عند -80 درجة مئوية أو في النيتروجين السائل وإذابة الجليد باتباع البروتوكولات القياسية لإذابة خطوط الخلايا. إذا تم تجميد الخلايا ، فلن يتم تعليقها في وسط مكمل ب EGF (وسط النمو). سيتم إعادة تعليقها في وسط أساسي (بدون EGF) ومحلول تجميد (نسبة 1/1).
- خلايا البذور عن طريق وضع 100 ميكرولتر من 600 ميكرولتر من تعليق الخلية / الوسائط في وسط ستة أغطية مطلية (انظر الخطوة 5) من اللوحة المكونة من 24 بئرا. ضع الطبق بعناية في الحاضنة واترك الخلايا تستقر.
ملاحظة: سيؤدي 100 ميكرولتر من معلق الخلية 600 ميكرولتر (يتم حصاده من بئر واحد من صفيحة 12 بئرا) إلى 90٪ -100٪ من التقاء الخلايا ، وهو أمر مطلوب للتعداد.
- افحص الخلايا بعد 3 ساعات لمعرفة ما إذا كانت قد استقرت على قسيمة الغطاء. أضف 400 ميكرولتر من وسط النمو المكمل ب EGF.
ملاحظة: عادة ما تكون الخلايا جاهزة للتعداء في اليوم التالي (الشكل 3G). إذا لم تكن ملتقية (90٪ -100٪) ، اتركها ليوم آخر. إذا لم تكن لا تزال متقاربة ، فلا تستخدمها في التعداد. إذا تم إجراء تطبيقات أخرى في المصب ، مثل توصيف miRNA أو RNA-Seq أو RT-qPCR أو اللطخة الغربية ، فيجب تمرير الخلايا إلى ألواح مكونة من 12 بئرا (نسبة 1: 1 ؛ لا يلزم معالجة اللوحة) وحصادها لاستخراج الحمض النووي الريبي / البروتين.
