Method Article

عزل مجموعات الخلايا عن أنسجة المخ باستخدام فرز النوى المنشط بالفلورة

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: موسى، ز.، وآخرون. عزل مجموعات الخلايا النجمية البشرية البالغة عن القشرة المجمدة الطازجة باستخدام فرز النوى التي يتم تنشيطها بالفلورة. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو إجراء عزل وفرز النوى من أنسجة الدماغ البشري المجمدة حديثا باستخدام فرز النوى المنشطة بالفلورة (FANS) ، والذي يتيح دراسة مجموعات الخلايا المختلفة لمختلف التطبيقات العصبية.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. إعداد المخزن

المؤقت

ملاحظة: في حالة إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي النهائي، عالج جميع مساحات العمل والأدوات بدقة باستخدام حل إزالة التلوث RNase لمنع تدهور الحمض النووي الريبي.

  1. تحضير المخزن المؤقت للتحلل.
    1. قم بإذابة ما يلي في الماء المقطر (H2O) حتى 50 مل: 5.47 جم من السكروز (0.32 م نهائي) ، 250 ميكرولتر من 1 M كلوريد الكالسيوم (CaCl2) (5 ملي مولار نهائي) ، 150 ميكرولتر من أسيتات المغنيسيوم 1 م (Mg (CH3COO) 2) (3 ملي مولار نهائي) ، 10 ميكرولتر من 500 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) (0.1 ملي مولار نهائي) ، 500 ميكرولتر من 1 M حمض تريس هيدروكلوريك (Tris-HCl) (درجة الحموضة 8) (10 ملي مولار نهائي) ، 50 ميكرولتر من Triton X-100 (0.1٪ نهائي) ، و 17 ميكرولتر من 3 M dithiothreitol (DTT ، 1 ملي مولار نهائي ، أضف طازجا) (انظر جدول المواد).
  2. تحضير السكروز عازلة
    1. قم بإذابة ما يلي في H2O المقطر حتى 50 مل: 30.78 جم من السكروز (1.8 م نهائي) ، 150 ميكرولتر من 1 م مجم (CH3COO) 2 (3 ملي مولار نهائي) ، 500 ميكرولتر من 1 M Tris-HCl (درجة الحموضة 8) (10 ملي مولار نهائي) ، 17 ميكرولتر من 3 M DTT (1 ملي مولار نهائي ، أضف طازجا).
فئة

2. تفكك الأنسجة المجمدة في تعليق أحادي النواة

  1. أضف 4 مل من محلول التحلل المثلج البارد إلى مطحنة مناديل زجاجية سعة 7 مل ، واستمر في وضع الثلج. قم بتشريح ما يقرب من 200-400 مجم من قشرة البالغين البشرية المجمدة حديثا ، وقم بتفريغ ما يقرب من 50 ضعفا ، وانقل الأنسجة المتجانسة إلى أنبوب بولي بروبيلين فائق الطرد المركزي سعة 12 مل.
  2. باستخدام ماصة سعة 5 مل ، أضف 6.5 مل من السكروز البارد إلى قاع أنبوب الطرد المركزي الفائق ، مع الحرص على عدم إزعاج الطبقة بين السكروز وتجانس الأنسجة.
    ملاحظة: في حالة معالجة عينات إضافية ، قم بموازنة الأنابيب بعناية حسب الوزن عن طريق إضافة مخزن مؤقت إضافي للتحلل إلى العينة الأخف. يعد التوازن الدقيق لأنابيب الطرد المركزي الفائق أمرا ضروريا لمنع تلف الدوار وضمان الدوران بالسرعة المناسبة.
فئة

3. الطرد المركزي الفائق

    جهاز
  1. الطرد المركزي الفائق المحلل عند 24,400 دورة في الدقيقة (101,814 × جم) لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية><. ملاحظه: قد لا تكون الحبيبات مرئية إذا بدأت بأقل من 200 ملغ من الأنسجة.
  2. أضف 600 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) (الكالسيوم (Ca2+) والمغنيسيوم (Mg2+) خالي) إلى حبيبات النوى واحتضنه على الجليد لمدة 10 دقائق قبل إعادة التعليق.
  3. الماصة لأعلى ولأسفل 50 مرة لإعادة تعليق حبيبات النوى على الجليد.
  4. استخدم مقياس كثافة الدم لتصور النوى السليمة تحت المجهر وللتأكد من أن تركيز إعادة التعليق أعلى من 105 نوى / مل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية (اجمع 10 ميكرولتر من النوى المعلقة مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق).
فئة

4. حضانة الأجسام المضادة

  1. لوضع علامة مناعية على العينة لفرز النوى المنشطة بالفلورة (FANS) ، أضف 500 ميكرولتر من حبيبات العينة المعلقة ، 490 ميكرولتر من 1x PBS (Ca2+ ، Mg2+ مجانا) ، 10 ميكرولتر من 10٪ ألبومين مصل البقر (BSA) (0.1٪ نهائي) ، 1 ميكرولتر من الجسم المضاد للفأر المضاد للنيوتروجين المقترن بالأذيني (أليكسا فلور) 555 (NeuN-AF555 ، التركيز النهائي 1: 1000) ، و 1 ميكرولتر من الجسم المضاد للفأر المضاد ل PAX6 المترافق مع الوفيكوسيانين (PAX6-APC ، التركيز النهائي 1: 1000).
    ملاحظه: يمكن إضافة الأجسام المضادة البديلة المترافقة مع الفلوروفورات الأخرى. هنا ، تم استخدام الفأر المضاد ل OLIG2 المترافق مع AF488 (تركيز 1: 1000) مع نتائج إيجابية.
  2. قم بإجراء عناصر تحكم 4 ′ و 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) فقط وأحادية اللون لإعداد معلمات البوابات ، باستخدام كمية صغيرة من العينة حسب الضرورة.
    1. لإجراء تحكم أحادي اللون AF555 ، أضف 20 ميكرولتر من حبيبات العينة المعلقة ، و 970 ميكرولتر من 1x PBS (Ca2+ ، Mg2+ مجانا) ، و 10 ميكرولتر من 10٪ BSA (0.1٪ نهائي) ، و 1 ميكرولتر من الجسم المضاد NeuN-AF555 (تركيز 1: 1000).
    2. لإجراء تحكم أحادي اللون APC ، أضف 20 ميكرولتر من حبيبات العينة المعلقة ، و 970 ميكرولتر من 1X PBS (Ca2+ ، Mg2+ مجانا) ، و 10 ميكرولتر من 10٪ BSA (0.1٪ نهائي) ، و 1 ميكرولتر من الجسم المضاد PAX6-APC (تركيز 1: 1000).
    3. لإجراء التحكم في DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) فقط, أضف 20 ميكرولتر من حبيبات العينة المعلقة, 970 ميكرولتر من 1X PBS (Ca2+, Mg2+ مجانا), و 10 ميكرولتر من 10٪ BSA (0.1٪ نهائي) (سيتم إضافة DAPI لاحقا, انظر 4.4).
      ملاحظه: إذا تم استخدام أكثر من جسمين مضادين ، يوصى بإجراء التحكم في التألق ناقص واحد (FMO) بالإضافة إلى عناصر التحكم أحادية اللون.
  3. احتضان العينات وأدوات التحكم مع الدوران في الظلام لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  4. أضف DAPI عند 1: 1000 إلى جميع العينات وعناصر التحكم ، وتابع الفرز.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments 10x PBS درجة الحموضة 7.2 إنفيتروجين 70013073 استنساخ الأجسام المضادة المضادة للنيون A60 ميليبور MAB377A5MI الفأر المضاد للنيو مترافق مع مركب الفلورسنت AF555 (الإثارة ، 553 نانومتر ؛ الانبعاث ، 568 نانومتر) استنساخ الأجسام المضادة المضادة للأوليغ 211 ميليبور MABN50A4MI الفأر المضاد ل OLIG2 مترافق مع مركب الفلورسنت AF488 (الإثارة ، 499 نانومتر ؛ الانبعاث ، 520 نانومتر) ألبومين مصل الأبقار صياد ص9704-100 غرفة عد الخط الساطع هوسر العلمية 3110 فولت كلوريد الكالسيوم اللامائي صياد [ك614-3] مصافي الخلايا ، 40 ميكرومتر SP Scienceware 136800040 DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole، ثنائي هيدروكلوريد) إنفيتروجين د1306 طاحونة المناديل Dounce ويتون 357542 فارز FACS BD Biosciences BD FACSAria III أسيتات المغنيسيوم رباعي الهيدرات صياد م 13-500 PAX6 (PAX6 / 496) - 100 اختبار نوفوس NBP234705J السكروز، معتمد من الكريستال، ACS، 500 ملجم صياد إس 5500 SW 41 Ti دوار دلو متأرجح بيكمان كولتر 331362 Tris-HCl ، محلول 1M ، درجة الحموضة 8.0 ، درجة البيولوجيا الجزيئية ، فائقة النقاء الترمو: العلمية J22638AE تريتونإكس-100 صياد بي بي 151-500 خافض للتوتر السطحي غير أيوني في محلول التحلل محلول تريبان الأزرق ، 0.4٪ جيبكو 15250061 جهاز طرد مركزي فائق بيكمان كولتر أوبتيما XE-100 أ 94516 أنابيب الطرد المركزي الفائق PP 9/16 X 3-1 / 2 بيكمان كولتر 331372 ماء مقطر فائق النقاء (خال من RNAse ، DNAse) إنفيتروجين 10977023 يشار إليه باسم الماء المقطر EDTA فائق النقاء تقنيات الحياة هاتف: 15576-028

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Activated Nuclei SortingNuclei IsolationBrain TissueFresh Frozen CortexDensity Gradient CentrifugationAntibody StainingNuclear StainingUltracentrifugationCell Population SortingNeurological Applications

Related Articles