الحصول على مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية من الحصين الفئران

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Schwarz، J. M. باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة لفحص التعبير الجيني الخاص بنوع الخلية في أنسجة دماغ الفئران. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لعزل الخلايا من الحصين الفئران ، بما في ذلك الخلايا العصبية والخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. جمع الأنسجة

1. قم بإعداد Buffer X من مجموعة التفكك العصبي عن طريق إضافة بيتا ميركابتو إيثانول إلى Buffer X إلى تركيز نهائي يبلغ 0.067 ملي مولار (بالنسبة ل 4 عينات ، أضف 13.5 ميكرولتر من 50 ملي مولار بيتا ميركابتو إيثانول إلى 10 مل من Buffer X).
2. تحضير مزيج الإنزيم 1 عن طريق خلط 50 ميكرولتر من إنزيم P مع 1,900 ميكرولتر من Buffer X لكل عينة كما هو موضح في بروتوكول مجموعة التفكك العصبي على سبيل المثال ، بالنسبة ل 4 عينات ، امزج 200 ميكرولتر من إنزيم P مع 7,600 ميكرولتر من Buffer X.
3. ضع Buffer X في الحمام المائي عند 37 درجة مئوية.
4. ضع 2 مل من محلول الملح المخزن البارد من هانك (HBSS) (بدون Ca ⁺⁺ و Mg ⁺⁺) في بئر واحد من صفيحة ثقافة معقمة مكونة من 6 آبار لكل عينة سيتم جمعها وحفظها على الجليد لتشريح الأنسجة.

< p class = "jove_title" >2. التفكك العصبي (1 ساعة)

1. قم بتقطيع كل عينة من الأنسجة إلى قطع صغيرة باستخدام شفرات حلاقة معقمة على غطاء لوحة الثقافة المكونة من 6 آبار. تم استخدام هذا البروتوكول لعينات الأنسجة التي تتراوح من حوالي 30 - 100 مجم ، ولكن تمت الموافقة عليه لعينات الأنسجة التي تصل إلى 400 مجم. بالنسبة لعينات الأنسجة التي يزيد حجمها عن 400 مجم ، يجب زيادة أحجام الكاشف بشكل مناسب.
2. استخدم 1 مل من HBSS الطازج بدون Ca²⁺ و Mg²⁺ لنقل قطع الأنسجة المقطعة بماصة إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 2 مل. كرر الخطوتين 2.1 و 2.2 لجميع العينات حتى يتم نقل جميع العينات إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل.
3. الطرد المركزي للعينات عند 300 × جم لمدة دقيقتين في RT وشفط الطاف.
4. أضف 1,900 ميكرولتر من مزيج الإنزيم الدافئ 1 ، كما هو موضح في الخطوتين 1.2 و 1.3 ، إلى كل عينة وأغلق الأنابيب.
5. احتضان العينات لمدة 15 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية ، مع قلب الأنابيب عدة مرات كل 5 دقائق لإعادة تعليق قطع الأنسجة المستقرة.
6. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد مزيج الإنزيم 2 عن طريق خلط 20 ميكرولتر من العازلة Y مع 10 ميكرولتر من الإنزيم A المذاب (ل 4 عينات ، اخلطي 80 ميكرولتر من Buffer Y مع 40 ميكرولتر من الإنزيم A المذاب).
7. أضف 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيم 2 إلى كل عينة واقلبها برفق. لا تدوام.
8. افصل كل عينة من الأنسجة بماصة باستور "1"، مع التكرار لأعلى ولأسفل 30 مرة.
9. احتضان العينات لمدة 15 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية ؛ اقلب الأنابيب عدة مرات كل 5 دقائق لإعادة تعليق قطع الأنسجة المستقرة.
10. افصل كل عينة من الأنسجة بماصة باستور "2"، مع التكرار لأعلى ولأسفل 30 مرة، وتجنب توليد الفقاعات.
11. افصل كل عينة من الأنسجة بماصة باستور "3" ، مع التكرار لأعلى ولأسفل 30 مرة ، وتجنب توليد الفقاعات.
12. احتضان العينات لمدة 10 دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية ؛ اقلب الأنابيب عدة مرات كل 5 دقائق لإعادة تعليق الخلايا المستقرة.
13. ضع معلقا أحادي الخلية على سلالة خلية 80 ميكرون موضوعة فوق أنبوب صقر سعة 15 مل لإزالة أي قطع كبيرة من الحطام وغسل الفلتر والخلايا ب 10 مل من HBSS (مع Ca²⁺ و Mg²⁺) لإيقاف تفاعلات الإنزيم. كرر حتى يتم نقل كل عينة إلى أنبوب صقر نظيف سعة 15 مل.
قم
14. بالطرد المركزي للعينات عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في RT وشفط المادة الطافية.

< p class = "jove_title" >3. استنفاد المايلين (45 دقيقة)

1. أعد تعليق حبيبات الخلايا تماما باستخدام 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين.
2. أضف كمية محددة من حبات إزالة المايلين والماصة لأعلى ولأسفل لخلطها جيدا.
   ملاحظه: يعتمد حجم حبات إزالة المايلين المستخدمة على حجم الأنسجة وعمر وكمية المايلين المتوقعة في تلك المنطقة المعينة من الدماغ. على سبيل المثال ، بالنسبة لعينة الحصين للفئران البالغة (حوالي 300 مجم) ، احتضن العينة ب 100 ميكرولتر من حبات إزالة المايلين.
3. احتضن لمدة 15 دقيقة في الثلاجة عند 4 درجات مئوية.
4. اغسل كل عينة ب 5 مل من محلول إزالة المايلين.
5. الطرد المركزي للعينات عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في RT.
6. أثناء الطرد المركزي للعينات ، ضع عمودا واحدا لكل عينة في المجال المغناطيسي للفارز المغناطيسي وضع مرشحا نظيفا 80 ميكرون أعلى كل عمود.
7. قم بإعداد الأعمدة والتصفية عن طريق شطف كل عمود ب 1 مل من المخزن المؤقت لإزالة المايلين ثلاث مرات (إجمالي 3 مل). اجمع كل التدفق في حاوية نفايات ، مثل الجزء السفلي من صندوق الطرف الفارغ.
8. ضع أنبوبا دائريا دائريا من البوليسترين سعة 5 مل أسفل كل عمود مباشرة استعدادا لجمع العينات.
9. عندما تنتهي الخلايا من الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية وأعد تعليقها تماما في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين. ضع تعليق الخلية على الفور على العمود واجمع الخلايا في الأنبوب أدناه.
10. اغسل الفلتر والعمود بمخزن مؤقت لإزالة المايلين 1 مل ، 4 مرات (إجمالي 4 مل).
11. جهاز الطرد المركزي لمجموعة الخلايا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في RT.
12. استنشق المادة الطافية والخلايا جاهزة الآن للتلطيخ.

< p class = "jove_title" >4. تلطيخ الخلايا الحية ل FACS (1 ساعة للتلطيخ)

1. دوامة لفترة وجيزة (2 ثانية) الخلايا لفصل الحبيبات وإضافة 5 ميكرولتر على الفور من كتلة Fc (مضادة لمجموعات التمايز 32 ، CD32) ، دوامة مرة أخرى ، واحتضانها في الثلاجة عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
2. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد خليط الأجسام المضادة الأولية عن طريق إضافة الأجسام المضادة الأولية الثلاثة في مخزن الغسيل على النحو التالي: 0.125 ميكرولتر من الجسم المضاد المترافق CD11b (1: 800) ، 1 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد ل GLT1 (1: 100) ، و 0.4 ميكرولتر من الجسم المضاد Thy1 المترافق Thy1 (1: 250) لكل 100 ميكرولتر من محلول الغسيل. ستتلقى كل عينة 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الأولية للحضانة ؛ ومع ذلك ، إذا كانت عينتك أكبر بكثير من 400 مجم من الأنسجة ، فقد ترغب في التفكير في زيادة حجم خليط الأجسام المضادة الأولية وفقا لذلك
3. قم بإعداد الأنابيب لأدوات التحكم في التلوين الفردية عن طريق إزالة 2 ميكرولتر فقط من الخلايا من كل أنبوب عينة وإضافتها إلى كل أنبوب تحكم في البقع. تشمل عناصر التحكم في "البقعة الواحدة": APC-CD11b فقط ، و GLT1 فقط ، و FITC-Thy1 فقط ، و PE الثانوي المضاد فقط ، والتحكم "الفارغ" أو غير الملطخ><. ملاحظه: يجب تمثيل جميع العينات في جميع أدوات التحكم في التلوين ، وبالتالي يجب إضافة 2 ميكرولتر من الخلايا من كل عينة إلى كل أنبوب تحكم في التلوين.
قم
4. بدوامة الأنابيب لفترة وجيزة (2 ثانية) وأضف 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الأولية إلى كل أنبوب عينة و 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المناسب لكل أنبوب تحكم في التلوين ، وقم بتدوير الأنابيب مرة أخرى ، وقم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم لحماية الأجسام المضادة الفلورية من أي ضوء ، واحتضان الأنابيب في الثلاجة عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. يجب أن تبقى العينات باردة (عند 4 درجات مئوية) لبقية الإجراء للحفاظ على سلامة العينات والأجسام المضادة.
قم
5. بدوامة الأنابيب لفترة وجيزة وأضف 2 مل من محلول الغسيل إلى كل أنبوب.
6. أنابيب الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
7. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد خليط الأجسام المضادة الثانوية عن طريق إضافة 0.2 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب المترافق ب PE لكل 100 ميكرولتر من محلول الغسيل. ستحصل كل عينة على 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الثانوية. ومع ذلك ، إذا كانت عينتك أكبر بكثير من 400 مجم من الأنسجة ، فقد ترغب في التفكير في زيادة حجم خليط الأجسام المضادة الأساسي وفقا لذلك.
8. عند اكتمال الطرد المركزي ، قم بتفريغ المادة الطافية من كل عينة في الحوض وامسح الأنابيب رأسا على عقب على منشفة ورقية.
قم
9. بدوامة الأنابيب لفترة وجيزة وأضف 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الثانوية إلى كل أنبوب عينة والجسم المضاد الثانوي المناسب لكل عنصر تحكم في التلوين. بعد ذلك ، قم بتدوير الأنابيب مرة أخرى ، وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم ، واحتضنها في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة < / > ملاحظه: يجب أن يحصل أنبوب التحكم في التلوين GLT1 فقط على خليط الجسم المضاد الثانوي.
10. بعد الحضانة ، قم بدوامة الأنابيب لفترة وجيزة وأضف 2 مل من محلول الغسيل إلى كل أنبوب.
11. الطرد المركزي الأنابيب عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
12. عند اكتمال الطرد المركزي ، قم بتفريغ المادة الطافية من كل عينة في الحوض وامسح الأنابيب رأسا على عقب على منشفة ورقية.
13. دوامة الأنابيب وإضافة 0.25 مل من PBS المعقم إلى كل أنبوب. العينات جاهزة للفرز.
    ملاحظه: قد تتطلب المزيد من الخلايا 0.5 مل من PBS المعقم. ومع ذلك ، فمن الأفضل أن تبدأ بحجم أقل حيث يمكن دائما تخفيف العينة إذا كانت مركزة جدا مع الخلايا.
    ملاحظه: اختياريا أضف DNase إلى الأنبوب لمنع الخلايا من التكتل وبالتالي انسداد فارز. يمكن أيضا تصفية العينات باستخدام مرشح معقم 80 ميكرون قبل الفرز مباشرة لتجنب انسداد الفارز.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات طقم التفكك العصبي (P) ميلتيني بيوتيك 130-092-628 حبات إزالة المايلين II ميلتيني بيوتيك 130-096-733 أعمدة LS ميلتيني بيوتيك 130-042-401 فاصل QuadroMACS ميلتيني بيوتيك 130-090-976 ماك متعددة الحامل ميلتيني بيوتيك 130-042-303 ورقة شبكة النايلون الامازون CMN-0074-10YD عرض 40 بوصة ، شبكة بحجم 80 ميكرون كتلة Fc / مضاد ل CD32 BD Biosciences BDB550270 تفاعل الفئران الجسم المضاد CD11b المترافق APC بيوليجند 201809 تفاعل الفئران أرنب مضاد ل GLT1 نوفوس بيولوجيكس NBP1-20136 تفاعل الفئران أو الإنسان الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب المترافق PE العلوم البيولوجية الإلكترونية 1037259 الجسم المضاد الثانوي لمضاد GLT1 الجسم المضاد للفأر CD90 (Thy1) المترافق مع FITC بيوليجند 202504 تفاعل الفئران