عزل الخلايا العصبية عن Caenorhabditis elegans عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة

الملخص

المصدر: ألمانيا، إي إم، وآخرون. عزل مجموعات عصبية معينة من الدودة المستديرة Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو عزل الخلايا العصبية المصنفة بالفلورسنت عن Caenorhabditis elegans. يتم الحصول على تعليق الخلية من الديدان المعدلة وراثيا المصممة للتعبير عن ناقلات الغشاء الحويصلية المنصهرة بالبروتين الفلوري في الخلايا العصبية الكولبينية. ثم يتم عزل الخلايا العصبية المصنفة بالفلورسنت باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) والحفاظ عليها في الثقافة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير وجمع الديدان القديمة لعزل الخلايا

1. اجمع الديدان وقم بإعداد المخازن المؤقتة لعزل الخلايا.
   1. اجمع الديدان في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. اغسل الديدان من الصفيحة التي تحتوي على 1.5 مل من المخزن المؤقت M9 (1 ملي مولار MgSO₄ ، 85 ملي كلوريد الصوديوم ، 42 ملي مولار Na₂HPO₄ ·7H₂O ، 22 ملي KH₂PO₄ ، درجة الحموضة 7.0) وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1,600 × جم. تخلص من المادة الطافية واغسل الديدان بسعة 1 مل من المخزن المؤقت M9. كرر الطرد المركزي واغسلها لمدة خمس مرات لإزالة أكبر قدر ممكن من تلوث الإشريكية القولونية.
      ملاحظة: يمكن أن تساعد إضافة المضادات الحيوية (50 ميكروغرام / مل) ، مثل الأمبيسلين ، في هذه الخطوة في تقليل التلوث البكتيري.
   2. بالنسبة لعينتين ، قم بإعداد 2 مل من محلول تحلل دوديسيل كبريتات ثنائي ثيوثريتول (SDS-DTT): 200 ملي مولار DTT ، 0.25٪ (وزن / حجم) SDS ، 20 ملي مولار HEPES (4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينات إيثان سلفونيك حمض (درجة الحموضة 8.0) ، و 3٪ (وزن / حجم) السكروز.
   3. قم بإعداد 15 مل من المخزن المؤقت للعزل (118 ملي كلوريد الصوديوم ، 48 ملي كلوريد كلوريد ، 2 ملي كلوريد_{الملكس 2} ، 2 ملي مللي كلوريد₂ ، 25 ملي هيبس [درجة الحموضة 7.3]) وقم بتخزينه على الثلج.
      ملاحظه: يجب أن يكون كل من المخزن المؤقت لتحلل SDS-DTT والمخزن المؤقت للعزل طازجا قبل كل تجربة.
2. اضطراب البشرة وعزل الخلية المفردة
   1. تم جمع الطرد المركزي في الخطوة 1.1.1 لمدة 5 دقائق عند 1,600 × جم. قم بإزالة جميع الديدان الطافية وتعليقها في 1 مل من وسائط M9 ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل.
   2. ديدان الحبيبات مع الطرد المركزي عند 1,600 × جم لمدة 5 دقائق.
   3. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل SDS-DTT إلى الديدان واحتضنه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). يجب أن تبدو الديدان وكأنها "متمزقة" على طول الجسم إذا تم عرضها تحت المجهر الضوئي.
      ملاحظه: قد يؤدي التعرض المطول للمخزن المؤقت لتحلل SDS-DTT إلى موت الديدان ، والتي يمكن مراقبتها من خلال مراقبة الديدان. سوف تستطيل الديدان الميتة ولن تتجعد.
   4. أضف 800 ميكرولتر من عازل العزل المثلج البارد واخلطه عن طريق تحريك الأنبوب برفق.
   5. ديدان الحبيبات لمدة 1 دقيقة عند 13,000 × جم عند 4 درجات مئوية ، قم بإزالة المادة الطافية وغسلها ب 1 مل من المخزن المؤقت للعزل.
   6. كرر الخطوة 1.3.5 لمدة خمس مرات ، مع إزالة المخزن المؤقت للعزل بعناية في كل مرة.
   7. أضف 100 ميكرولتر من خليط البروتياز من Streptomyces griseus (15 مجم / مل) (جدول المواد) المذاب في مخزن مؤقت معزول إلى الحبيبات واحتضانه لمدة 10-15 دقيقة عند RT.
      ملاحظه: كما هو الحال مع المخزن المؤقت لتحلل SDS-DTT ، قد يؤدي هضم البروتياز الممتد إلى انقسام مفرط للبروتينات على طول غشاء البلازما ، مما يمنع عزل بروتين الفلورسنت الأخضر المكشوف للسطح (GFP) عبر الخرز المغناطيسي.
   8. أثناء الحضانة بخليط البروتياز ، قم بتطبيق التعطيل الميكانيكي عن طريق سحب عينات العينة لأعلى ولأسفل على قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل بطرف ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر ~ 60-70 مرة. حافظ على طرف الماصة على جدار أنبوب الطرد المركزي الدقيق بضغط ثابت لفصل الخلايا بشكل صحيح.
   9. لتحديد مرحلة الهضم ، قم بإزالة حجم صغير (~ 1-5 ميكرولتر) من خليط الهضم ، وقم بإسقاطه على شريحة زجاجية وفحصه باستخدام مجهر زراعة الأنسجة. بعد 5-7 دقائق من الحضانة ، يجب أن تكون شظايا الدودة قد قللت بشرة بشكل واضح وسيكون ملاط الخلايا مرئيا بسهولة.
   10. توقف التفاعل مع 900 ميكرولتر من وسط ليبوفيتز البارد L-15 المتاح تجاريا المكمل بمصل الأبقار الجنينية بنسبة 10٪ (FBS) والبنسلين والستربتومايسين (التركيز النهائي عند 50 وحدة / مل بنسلين و 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين).
   11. حبيبات الشظايا والخلايا المعزولة عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 10,000 × جم عند 4 درجات مئوية. اغسل الخلايا المحببة ب 1 مل من الوسائط الباردة المكملة ب L-15 مرتين أخريين لضمان إزالة الحطام الزائد والبشرة.
   12. أعد تعليق الخلايا المحببة في 1 مل من الوسائط المكملة ب L-15 واتركها على الثلج لمدة 30 دقيقة. خذ الطبقة العليا ، حوالي 700-800 ميكرولتر ، إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. تحتوي هذه الطبقة على خلايا بدون بقايا خلية وسيتم استخدامها في العزل اللاحق للخلايا ذات الأهمية.
   13. باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، استخدم عداد الخلايا الآلي أو مقياس كثافة الدم لقياس كثافة الخلية من 10-25 ميكرولتر من الخلايا المعزولة.

< p class = "jove_title" >2. عزل الخلايا الإيجابية ل GFP عن طريق قياس التدفق الخلوي

1. عزل الخلايا الإيجابية ل GFP عن طريق قياس التدفق الخلوي
   1. من تعليق الخلية المعزولة التي تم جمعها في الخطوة 1.2.12 ، خلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 10,000 × جم عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية الخلايا المحببة في وسط مكمل L-15 إلى كثافة خلية لا تزيد عن 6 × 10⁶ خلايا / مل لتجنب التحميل الزائد على مقياس التدفق الخلوي.
   2. قم بفرز الخلايا حسب التعبير الإيجابي ل GFP باستخدام مقياس التدفق الخلوي القادر على فرز العينات. يمكن استخدام الخلايا السالبة GFP كعنصر تحكم في التحليل المحدد لنوع الخلية غير النوعي.
2. استزراع الخلايا المعزولة
   1. صفيحة الخلايا المعزولة في لوحة معقمة متعددة الآبار 6 آبار.
      ملاحظه: قد تكون هذه الألواح مغلفة بليكتين الفول السوداني لزيادة ارتباط الخلية. ومع ذلك ، إذا كان سيتم استخدام الخلايا على الفور ، فقد يتم تجاهل هذه الخطوة.
   2. ضع اللوحة في وعاء بلاستيكي واحتضن الخلايا عند 20 درجة مئوية بمنديل مبلل أو مناديل ورقية ناعمة (أضف 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين إلى الماء المقطر المزدوج [ddH₂O] لضمان عدم نمو البكتيريا عند المسح) لإضافة الرطوبة إلى الخلايا. لا تحتضن في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ ، لأن مستويات ثاني أكسيد الكربون المرتفعة قد تلحق الضرر بالخلايا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 6 آبار لوحة فيشر ساينتيك 12-556-004 أجار ، درجة البيولوجيا الجزيئية VWR أ 0930 كلوريد_{الهواء 2} سيغما سي 5670 عداد الخلايا الآلي Contess إنفيتروجين Z359629 DTT يو بي آيولوجي D8070 FBS أوميغا العلمية FB-02 هيبس سيغما إتش 3375 كيه سي إل أمريسكو [أ395] KH₂PO₄ يو بي آيولوجي ص 5110 كيمويبس كيمبرلي كلارك للمحترفين 7552 ليبوفيتز L-15 متوسط جيبكو 21083027 مغنكلوريد₂ سيغما M8266 MgSO₄ يو بي آيولوجي M2090 نا₂HPO₄ · 7 ساعات₂O يو بي آيولوجي س 5199 كلوريد الصوديوم VWR إكس 190 NaOCl (التبييض) كلوركس هيدروكسيد الصوديوميوم أمريسكو [و583] البنسلين - الستربتوميسين فيشر ساينتيك 15140122 الببتون واي يو بي آيولوجي ص 3306 بروناز إي سيغما 7433 خليط البروتياز من Streptomyces griseus الحزب الديمقراطي الصربي أمريسكو [أو227] SMT1-FLQC مجهر مجسم مضان أبحاث Tritech سكروز يو بي آيولوجي S8010