تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< ص الفئة = "jove_title" >
1. تشريح جنين الدجاج اليوم 14 (e14) المخيخ
- احتضان بيض الدجاج المخخص البني عند 38 درجة مئوية إلى اليوم الجنيني 14.
- باستخدام مقص البيض ، اقطع رأس جنين الفرخ في البيض وقم بإزالة الرأس إلى طبق بتري يحتوي على محلول ملحي عازل للفوسفات المثلج (PBS) (الشكل 1 أ).
- باستخدام ملقط قياسي ، قم بعمل شقوق خلف كل عين على طول الطريق عبر الأنسجة ، وإزالة العينين والفك العلوي. قم بعمل شق ثان على طول الطريق عبر البلعوم ، وإزالة الفك السفلي (الشكل 1 ب).
- باستخدام ملقط قياسي ، قم بإزالة كل الجلد من سطح الجمجمة عن طريق تقشيرها بعيدا (الشكل 1 ج) وإزالة العظام الأمامية والجدارية ، مما يكشف عن الدماغ.
- من الجانب البطني ، قم بإزالة الغضروف البلعومي واللحمة المتوسطة المساعدة.
- من الجانب الظهري ، قم بإزالة اللحمة المتوسطة الظهرية بعناية إلى الدماغ الخلفي ، مع الحرص على عدم إتلاف البي ، وفصل الدماغ بأكمله (الشكل 1 د).
- قم بعمل شق على طول الطريق عبر الأنسجة بين الدماغ الأوسط والدماغ الخلفي وافصل الدماغ الخلفي ، بما في ذلك المخيخ (الشكل 1E).
- قم بإزالة المخيخ بالكامل عن طريق عمل شقوق على طول الطريق عبر الأنسجة عند كل من التقاطعات الجانبية للمخيخ والصفيحة الخلفية للدماغ الخلفي ، مع الحرص على الحفاظ على سلامة البي طوال فترة التشريح (الشكل 1F). أيضا ، قم بإزالة الضفيرة المشيمية المكونة (الشكل 1G).
- انقل المخيخ المفصل إلى محلول الملح المتوازن من هانك المثلج (HBSS).
< p class = "jove_title" >
2. شريحة ثقافة المخيخ e14
- انقل المخيخ بالكامل إلى المنصة المعقمة لمفرمة المناديل باستخدام ملعقة أو ماصة باستور سعة 3 مل مع قطع الحافة لتوسيع الفتحة. قم بإزالة السوائل الزائدة باستخدام ماصة.
- قم بقص المخيخ بالكامل في الاتجاه المطلوب بسماكة 300 ميكرومتر باستخدام مجموعة مفرمة المناديل بسرعة قطع بنسبة 50٪ من الحد الأقصى. يتم الحفاظ على سلامة الأنسجة بسهولة في القسم السهمي. ومع ذلك ، يعد التوجيه أيضا اعتبارا مهما لتحليل الخلايا (يتم محاذاة تشعبات خلايا بركنجي سهمي ، بينما تعمل محاور الخلايا الحبيبية بشكل عرضي ، عموديا على مستوى تشعبات خلايا بركنجي).
- باستخدام ماصة باستور سعة 3 مل ، قم بتغطية المخيخ المقطع في HBSS المثلج.
- انقل الشرائح في HBSS إلى طبق بتري مقاس 60 مم يحتوي على HBSS طازج مثلج باستخدام ماصة باستور سعة 3 مل برأس مقطوع.
- تحت مجهر تشريح مضاء بمصدر ضوء من الألياف البصرية، تأكد من فصل الشرائح الفردية باستخدام ملقط صانع الساعات.
ملاحظه: يستغرق كل تشريح ، من الجنين إلى حضانة الشريحة في وسط الاستزراع ، حوالي 10-20 دقيقة ، اعتمادا على الخبرة. قم بإجراء التشريح واحدا تلو الآخر للتأكد من أن المخيخ يقضي الحد الأدنى من الوقت بين قطع الرأس وثقافة خارج الجسم الحي.
