إنشاء مزارع الخلايا الدبقية المختلطة الأولية من الحبل الشوكي للفأر

الملخص

المصدر: Malon، J. T.، et al. تحضير الثقافات الدبقية الأولية المختلطة من أنسجة الحبل الشوكي للفأر البالغ.

يوضح هذا الفيديو تقنية لعزل واستزراع الخلايا الدبقية الأولية المختلطة من أنسجة الحبل الشوكي للفأر البالغ. يتضمن البروتوكول الهضم الأنزيمي للأنسجة ، متبوعا بإزالة أغشية الخلايا المكسورة وحطام المايلين للحصول على مجموعة من خلية واحدة. ثم يتم زراعة الخلايا في وسائط محسنة لنمو الخلايا الدبقية المختلطة.

البروتوكول

1. تحضير الحلول في غطاء ثقافة تحت ظروف معقمة

1. تحضير وسائط الاستزراع: أكمل تعديل Dulbecco لوسائط النسر (cDMEM) التي تحتوي على DMEM (مع 4.5 جم / لتر جلوكوز) ، و 10٪ مصل بقري جنين (FBS) ، و 2 ملي مولار لجلوتامين ، و 100 وحدة دولية / مل بنسلين ، و 100 مجم / مل ستربتومايسين ، و 250 نانوغرام / مل أمفوتريسين ب ، و 50 ميكرومتر 2-ميركابتو إيثانول (2-ME ؛ انظر 1.1.1). امزج وقم بتصفية تعقيم جميع المكونات الأخرى ثم أضف FBS. قم بتخزين وسائط الاستزراع في درجة حرارة 4 ^درجات مئوية.
   1. قم بإعداد محلول مخزون 50 ملي مولار 2-ME / محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): أضف 100 ميكرولتر من 2-ME المركز (14.3 م) إلى 28.6 مل من 1x PBS ، وقم بتعقيمه (يمكن تخزين المحلول عند 4 ^درجات مئوية لعدة أشهر). استخدم 1 مل من محلول مخزون 2-ME لكل 1,000 مل من وسائط الاستزراع.
2. إعداد وسائط تدرج الكثافة
   1. قم بإعداد محلول وسائط تدرج متساوي التوتر للمخزون (على سبيل المثال ، 100٪ بيركول) من 1 جزء 10x PBS معقم منتظم و 9 أجزاء وسائط تدرج كثافة مخزون معقمة (على سبيل المثال ، Percoll).
   2. قم بتخفيف وسائط التدرج الكثافة بنسبة 100٪ (المصنوعة في 1.2.1) باستخدام PBS معقم 1x عادي لعمل وسائط متدرجة كثافة 20٪ (على سبيل المثال ، 10 مل من وسائط التدرج الكثافة 100٪ مع 40 مل من 1x PBS) وتخزينها عند 4 ^درجات مئوية. قم بإحضار وسائط التدرج الكثافة 20٪ إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل تحضير زراعة الخلية.
3. تحضير المحاليل من نظام تفكك غراء
   ملاحظة: يمكن تحديد نظام تفكك غراء في جدول المواد. يمكن أيضا استخدام مجموعات التفكك المماثلة الأخرى (بما في ذلك تلك التي يتم تجميعها داخليا). يجب أن تكون جميع المكونات معقمة.
   1. أضف 32 مل من محلول الملح المتوازن من إيرل (EBSS) إلى خليط مثبطات التلويض (مسحوق).
   2. أضف 5 مل من EBSS إلى قارورة غراء واحدة (مسحوق). ضع قارورة الغراء في حمام مائي 37 ^{درجة مئوية} لمدة 10 دقائق أو حتى يذوب الغرائ.
   3. أضف 500 ميكرولتر من EBSS إلى قارورة DNase واحدة (مسحوق). تخلط بلطف.
   4. أضف 250 ميكرولتر من محلول DNase (أعلاه) إلى قارورة غراء.
   5. احسب الكمية الإجمالية لخليط غراء / DNase أعلاه المطلوب (حوالي 800 ميكرولتر من خليط غراء / DNase لكل حبل شوكي للفأر) ونقل الخليط المطلوب إلى أنبوب 50 مل لهضم الأنسجة. قم بتخزين القارورة المتبقية في القارورة الأصلية عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين على الأقل.
   6. احتفظ بجميع المكونات من المجموعات على الثلج لحين الحاجة.
4. تحضير أنابيب تجميع الحبل الشوكي: أنبوب واحد معقم سعة 15 مل مع 5 مل من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS ؛ من نظام تفكك غراء ، لجمع الحبل الشوكي) وأنبوب معقم 15 مل مع 1x PBS (لملء حقنة 5 مل). بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد طبق بتري معقم واحد (35 مم أو 60 مم) مع 5 مل من HBSS واحتفظ به في غطاء المزرعة.

< p class = "jove_title" >2. تحضير تعليق الخلية الواحدة

ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوتين 3 و 4 في غطاء الثقافة للحفاظ على كل شيء معقما.

1. نقل جميع الحبال الشوكية إلى طبق بتري المحتوي على HBSS. قطع كل من الحبل الشوكي إلى العديد من القطع الدقيقة والصغيرة بمقص معقم وملقط. انقل أنسجة الحبل الشوكي إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على خليط إنزيم غراء / DNase المحضر (الخطوة 1.3.5) باستخدام ملقط معقم أو ماصة 10 مل (تجنب إضافة HBSS إلى خليط الإنزيم ، لأن هذا سيؤدي إلى تخفيف محلول الإنزيم المحضر وقد يؤدي إلى انخفاض أداء الإنزيم).
2. دوامة الأنبوب برفق للخلط. احتضان الأنبوب عند 37 ^درجةمئوية لمدة ساعة واحدة في حاضنة / شاكر مع اهتزاز مداري عند 150 دورة في الدقيقة.
3. قم بتدوير الأنبوب مرة أخرى وقم بترتيبول محلول الإنزيم بقوة مع الأنسجة باستخدام ماصة سعة 5 مل لتعزيز المزيد من التفكك.
4. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند RT.
5. أثناء الطرد المركزي ، قم بخلط 2.7 مل من EBSS مع 300 ميكرولتر من محلول مثبط الألبومين - البيضاوي المعاد تكوينه (1.3.1) في أنبوب معقم. أضف 150 ميكرولتر من محلول DNase (الخطوة 1.3.3).
6. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية بالمحلول المحضر أعلاه (الخطوة 1.5). دوامة جيدا لكسر بيليه الخلية.
7. أضف 3 مل من محلول مثبط الألبومين البيضي المعاد تكوينه (الخطوة 1.4.1) إلى تعليق الخلية. خلايا الطرد المركزي عند 70 × جم لمدة 6 دقائق في RT. قم بإزالة المادة الطافية (التي تحتوي على شظايا الغشاء).

فئة

3. مزيد من إزالة المايلين من تعليق الخلية الواحدة

1. أضف 8 مل من وسائط التدرج الكثافة 20٪ (المحضرة في الخطوة 1.2.2) في الأنبوب الذي يحتوي على حبيبات الخلية ، وقم بالدوامة برفق لتعطيل الحبيبات ، وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 800 × جم لمدة 30 دقيقة عند RT دون فرملة. قم بإزالة الطبقة العليا من الحطام (معظمها من المايلين) والمادة الطافية بعناية ولكن احتفظ بالحبيبات.
2. لإزالة بقايا تدرج الكثافة ، اغسل الخلايا عن طريق إعادة تعليق حبيبات الخلية ب 8 مل من cDMEM المخفف (1 جزء cDMEM و 2 جزء HBSS). قم بالطرد المركزي للخلايا عند 400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 ^درجاتمئوية ، قم بإزالة المادة الطافية وغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام cDMEM المخفف (أعلاه) بنفس الطريقة. احتفظ بالخلايا على الجليد حتى بذرها.
3. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في وسط الاستزراع (cDMEM المزود ب 2-ME (محضر في الخطوة 1.1)). بالنسبة للوحة واحدة مكونة من 12 بئرا ، استخدم 3 مل × 4 (عدد الفئران المستخدمة) + 2 مل = 14 مل من الوسائط. سيضمن ذلك وجود تعليق خلوي كاف للوحة بأكملها (12 بئرا) وسيوفر آبارا إضافية يمكن استخدامها لتحديد متوسط عدد الخلايا لكل بئر ومحتوى الخلايا الدبقية الصغيرة للثقافة. إذا كان سيتم استخدام أنواع أخرى من أوعية الاستزراع، احسب الحجم الإجمالي لوسائط الاستزراع المطلوبة بشكل متناسب.
4. أضف 1 مل من تعليق الخلية في كل بئر من صفيحة 12 بئرا.
5. احتضان الخلايا عند 35.9 ^{درجة مئوية}مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
6. قم بتغيير الوسائط (قم بإزالة الوسائط القديمة عن طريق الشفط) على D 1 ثم كل 3 - 4 d بعد ذلك (عادة ما قم بتغيير الوسائط على D: 1 و 4 و 8 و 11 ، ثم استخدم الخلايا في اليوم 12).
   ملاحظه: في اليوم الأول ، قد تحتوي الثقافة على كميات كبيرة من الحطام بسبب بقايا المايلين من أنسجة الحبل الشوكي. وبالتالي ، يوصى بتغيير الوسائط في اليوم الأول. الثقافات جاهزة للعلاج بين D 12 - 14. عادة ما تكون الخلايا ملتقية بنسبة 80٪ عند D 12 ويمكن أن تكون قريبة من 100٪ من D 14. عادة ، في D 12 ، يوجد حوالي 100,000 خلية لكل بئر في صفيحة مكونة من 12 بئرا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات تعديل Dulbecco لوسائط Eagle's (DMEM) مع 4.5 جم / لتر من الجلوكوز لونزا 12-709 فهرنهايت وسائط cDMEM هي وسائط ثقافة قياسية ومستخدمة على نطاق واسع.
يمكن للباحثين الأفراد تحديد مكان شراء DMEM وجميع المكونات الأخرى المستخدمة في صنع وسائط cDMEM. L-جلوتامين (100x) لونزا 17-605 [إ] L-glutamine هو مكون قياسي يستخدم على نطاق واسع لوسائط الثقافة المختلفة. يمكن للباحثين الأفراد أن يقرروا مكان شراء L-glutamine. محلول مضاد حيوي مضاد للفطريات (100x) كورنينج ميدياتك 30-004-CI هذا مزيج من البنسلين والستربتومايسين والأمفوتريسين مصمم ليحتوي على 10,000 وحدة / مل من البنسلين G و 10 مجم / مل من كبريتات الستربتومايسين و 25 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين B. يمكن للباحثين الأفراد تحديد مكان شراء المكونات الفردية. 2-ميركابتو إيثانول (2-ME) سيجما ألدريتش م 3148 كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا والبيولوجيا الجزيئية والرحلان الكهربائي. نظام تفكك غراء شركة ورثينجتون للكيمياء الحيوية LK003150 يمكن شراء المكونات الفردية لهذه المجموعة بشكل منفصل. بيركول جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 17-0891-01 يباع Percoll كمحلول معقم. يمكن إعادة تعقيم Percoll غير المخفف إذا لزم الأمر. حاضنة / شاكر خط المختبر بارستيد / خط المختبر ماكس Q4000 هذه هي الحاضنة / شاكر لدينا حاليا. يمكن استخدام أنواع أخرى من الهزازات بدلا من ذلك.