$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. الحفاظ على التجديد الذاتي في خلايا IMOP
- تحضير وسائط زراعة iMOP: DMEM / F12 ، مكمل 1X B27 ، 25 ميكروغرام / مل كاربينيسيلين و 20 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF). اصنع 50 مل من وسائط ثقافة iMOP باستخدام كواشف معقمة. قم بتسخين 49 مل من DMEM / F12 في مخروطي الشكل سعة 50 مل في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- قم بإذابة مكمل 50X B27 ومعقم بالفلتر 100 مجم / مل من الكربينيسيلين لمدة 5 دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية. قم بإذابة 100 ميكروغرام / مل bFGF في RT. أضف 1 مل 50X B27 و 10 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل bFGF و 12.5 ميكرولتر من 100 مجم / مل كاربينيسيلين في DMEM / F12.
- استخدم 3 مل من الوسائط في طبق زراعة الأنسجة مقاس 60 مم لزراعة خلايا iMOP. أضف وسائط جديدة إلى الثقافات كل يومين عن طريق مضاعفة حجم الوسائط. تأكد من أن تركيز bFGF لا ينخفض عن 5 نانوغرام / مل.
- زراعة خلايا iMOP عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. خلايا المرور في المزرعة بعد 5-7 أيام كما هو موضح في الخطوات أدناه. انقل المزرعة إلى شكل مخروطي سعة 15 مل باستخدام طرف ماصة سعة 10 مل.
- اصنع 1 ملي EDTA في HBSS عن طريق تخفيف 0.1 مل من 0.5 M EDTA pH 8.0 إلى 50 مل من HBSS. 1 ملي EDTA دافئ مسبقا مصنوع من HBSS في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- حصاد الخلايا عن طريق الترسيب بالجاذبية أو الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في RT. لترسيب الجاذبية ، ضع 15 مل مخروطي الشكل يحتوي على المزارع في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق. بعد ذلك الوقت ، لاحظ أن الغلاف الجوي يتجمع في الجزء السفلي من 15 مل مخروطي الشكل.
ملاحظه: يمكن أن تتسبب قوة الطرد المركزي المفرطة في تلف الخلايا.
- استنشق الوسائط المستهلكة بعناية باستخدام ماصة شفط سعة 2 مل دون إزعاج حبيبات الخلية. أضف 0.5 مل من محلول 1 ملي مولار EDTA HBSS الدافئ مسبقا إلى حبيبات الخلية. باستخدام ماصة P1000، قم بسحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل 2-3 مرات. ضع مخروطي الشكل عند 37 درجة مئوية واحتضنه لمدة <5 دقيقة لتسهيل التفكك في خلايا مفردة.
- قم بتدوير محلول الخلية برفق لتحديد ما إذا كانت الغلاف الجوي قد تم فصلها. إذا لم ترسب الغلاف الأذني إلى قاع المخروطي ، يتم فصل الخلايا. قد يختلف وقت الحضانة.
ملاحظه: سيؤدي الحضانة المطولة باستخدام EDTA إلى موت الخلايا المفرط.
- قم بإزالة الخلايا من 37 درجة مئوية ، وأضف 2 مل من الوسائط لتحييد وتخفيف EDTA. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في RT. قم بشفط EDTA المخفف باستخدام ماصة شفط سعة 2 مل وأضف 5 مل من 1X PBS لغسل الخلايا.
- قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند RT وشفط 1X PBS باستخدام ماصة شفط سعة 2 مل. أعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة P1000 في 0.5 مل من وسائط زراعة iMOP عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل 2-3 مرات.
- عد الخلايا باستخدام عداد جسيمات الموائع الدقيقة مع الكاسيت المناسب. ستحتوي لوحة متجمعة من خلايا iMOP على ~ 6 X106 خلايا. قم بتخفيف الخلايا 1: 100 في الوسائط وأضف 75 ميكرولتر من محلول الخلية إلى الكاسيت للعد. لوحة 1 × 106 خلايا في طبق 6 سم في وسائط ثقافة iMOP (~ 1:10 تخفيف). تمرير iMOPs كل 5 - 7 أيام.
ملاحظه: سوف تتمايز الخلايا التي تشكل غلاف الأذن الكبير أو ترتبط بالجزء السفلي من طبق زراعة الأنسجة. تموت الخلايا أيضا إذا كانت الثقافات شديدة التقاء.
< p class = "jove_title" >
2. تمييز خلايا IMOP إلى ظهارة حسية
- تحضير 50 مل من وسائط التمايز الظهارية الحسية iMOP: DMEM / F12 ، مكمل 1X B27 ، 25 ميكروغرام / مل كاربينيسيلين. اصنع 50 مل من وسائط التمايز الظهارية الحسية iMOP. قم بتسخين 49 مل من DMEM / F12 في مخروطي الشكل سعة 50 مل في حمام مائي 37 درجة مئوية. قم بإذابة مكمل 50X B27 و 100 مجم / مل من الكاربينيسيلين لمدة 5 دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية. أضف 1 مل 50X B27 و 12.5 ميكرولتر من 100 مجم / مل كاربينيسيلين إلى DMEM / F12.
- لحصاد الخلايا وفصلها وإعادة تعليقها وعد الخلايا ، كرر الخطوات 1.4-1.9
- طبق 1 × 106 خلايا في طبق 6 سم في اليوم -3 باستخدام وسائط ثقافة iMOP. في اليوم 0 ، انقل المزرعات باستخدام ماصة سعة 10 مل إلى مخروطية سعة 15 مل. اجمع الغلاف الجوي عن طريق ترسيب الجاذبية ، كما هو مذكور في الخطوة 1.6. قم بشفط الوسائط المستهلكة باستخدام ماصة شفاقت سعة 2 مل واترك الغلاف الأذني في الجزء السفلي من المخروطي.
- أضف برفق 2 مل من وسائط التمايز الظهارية الحسية. انقل الغلاف الجوي إلى طبق 6 سم باستخدام ماصة كبيرة 10 مل.
ملاحظه: يمكن أن يؤدي القص الميكانيكي الناتج عن الماصة القاسية إلى فصل الخلايا عن الغلاف الأذني.
- أضف 2 مل من وسائط التمايز الظهارية الحسية الطازجة إلى الثقافات كل يومين. إذا لزم الأمر ، يمكن جمع الخلايا عن طريق ترسيب الجاذبية واستبدال الوسائط.
- اجمع الغلاف الجوي في اليوم 10 عن طريق النقل إلى شكل مخروطي سعة 15 مل والسماح للغلاف الجوي بالترسيب كما هو مذكور في الخطوة 1.6. استنشق الوسائط المستهلكة باستخدام ماصة شفط سعة 2 مل واترك الغلاف الأذني دون إزعاج.
- قم بإصلاح الغلاف الجوي عن طريق احتضان 4٪ فورمالديهايد في 1X PBS لمدة 15 دقيقة في RT. قم بإزالة محلول الفورمالديهايد واغسل الغلاف الجوي بمحلول غسيل (1X PBS يحتوي على 0.1٪ TritonX-100) قبل احتضانها في مخزن مؤقت مانع (1X PBS يحتوي على 10٪ مصل ماعز عادي و 0.1٪ Triton X-100) لمدة ساعة واحدة.
- استبدل المخزن المؤقت واحتضان العينات في المخزن المؤقت المانع بجسم مضاد مخفف. احتضان عند 4 درجات مئوية. اغسل العينات باستخدام 1X PBS يحتوي على 0.1٪ Triton X-100 وقم بإخضاع الغلاف الجوي للتلطيخ المناعي. انقل الغلاف الأذني إلى 1X PBS وضع الغلاف الجوي في وسائط التثبيت على شريحة زجاجية باستخدام ماصة P1000. ضع غطاء فوق العينة واترك وسائط التركيب تجف عند 4 درجات مئوية.
- احصل على صور epifluorescence باستخدام إعداد مجهر مقلوب مزود بكاميرا CCD 16 بت وإما 20X 0.75 هواء أو هدف غمر زيت 40X 1.3 NA. اجمع التألق من قنوات الألوان المختلفة باستخدام الأطوال الموجية المدرجة (الإثارة والانبعاث): الأزرق (377 ± 25 نانومتر / 447 ± 30 نانومتر) ، الأخضر (475 ± 25 نانومتر / 540 ± 25 نانومتر) ، أحمر (562 ± 20 نانومتر / و 625 ± 20 نانومتر) والأشعة تحت الحمراء (628 ± 20 نانومتر / و 692 ± 20 نانومتر).