مقالة منهجية

تمييز أسلاف الأذن متعددة القدرات الخالدة إلى الخلايا العصبية العقدية الحلزونية وتقييم التمايز

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Azadeh, J., et al. بدء التمايز في الخلايا السلفية متعددة القدرات للأذن. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح الفيديو تمايز أسلاف الأذن متعددة القدرات الخالدة (iMOPs) إلى الخلايا العصبية العقدية الحلزونية (SGNs) والتأكيد القائم على التألق المناعي للتمايز. يتم طلاء iMOPs على أغطية مغلفة بالركيزة المزروعة في وسط تمايز عصبي للتمايز إلى SGNs. يتم تصنيف الخلايا المتمايزة بأجسام مضادة خاصة بعلامات التمايز العصبي وتحليلها تحت المجهر لتأكيد التمايز.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. التمييز بين الخلايا العصبية المشتقة من iMOP

  1. اصنع 50 مل من وسائط التمايز العصبية: الوسائط العصبية القاعدية ، مكمل 1X B27 ، 2 ملي مولار L-Glutamine. قم بإذابة زجاجة 50X B27 و 200 ملي من L-Glutamine في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أضف 1 مل 50X B27 و 0.5 مل 200 ملي من L-Glutamine إلى 48.5 مل من الوسائط العصبية القاعدية.
  2. قم بتغطية الغطاء الزجاجي عن طريق وضع أغطية زجاجية مستديرة مقاس 12 مم مقاس 1.5 في صفيحة معقمة مقاس 10 سم وإضافة 70٪ من الإيثانول (EtOH) إلى اللوحة لتعقيم وتنظيف الأغطية.
  3. حرك الغطاء برفق للتأكد من تغطيتها بالإيثانول. اترك الطبق لمدة 10 دقائق في RT. اشطف الغطاء 3 مرات بمحلول ملحي معقم 1X مخزن بالفوسفات (PBS) لغسل الإيثانول المتبقي. اشطف الغطاء مرة واحدة باستخدام H2O المعقم لغسل 1X PBS المتبقي.
  4. قم بشفط H2O باستخدام ماصة شفط سعة 2 مل واترك الغطاء يجف. قم بتعريض الغطاء للأشعة فوق البنفسجية في غطاء مزرعة الأنسجة لمدة 15 دقيقة. قم بتخزين أغطية الأغطية في بيئة معقمة إذا لم يتم استخدامها على الفور.
  5. ضع غطاء دائري 12 مم في كل بئر من طبق 24 بئر. رج اللوحة برفق للتأكد من أن الأغطية مسطحة في قاع البئر.
  6. قم بإذابة محلول مخزون 2 مجم / مل من بولي دي ليسين في درجة حرارة الغرفة (RT) وتخفيفه إلى 10 ميكروغرام / مل بتركيز بولي دي ليسين في 1X PBS. أضف 0.25 مل من 10 ميكروغرام / مل بولي دي ليسين إلى الآبار. اترك الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  7. اغسل الآبار 3 مرات باستخدام 1X PBS المعقم. قم بإذابة محلول مخزون اللامينين 10 مجم / مل في RT وتخفيفه إلى 10 ميكروغرام / مل في 1X PBS. أضف 0.25 مل من محلول عمل اللامينين 10 ميكروغرام / مل في بئر واحد من طبق متعدد البئر 24. احتضان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية. قم بشفط محلول اللامينين باستخدام ماصة شفط سعة 2 مل.
  8. اغسل الغطاء 3 مرات باستخدام 1X PBS عن طريق إضافة 1 مل من 1X PBS باستخدام ماصة P1000 وإزالة 1X PBS عن طريق الشفط باستخدام ماصة شفط سعة 2 مل. اترك 1X PBS من آخر غسلة في البئر حتى تصبح الخلايا جاهزة للطلاء. بدء التمايز العصبي عن طريق الحصاد, تفكك وعد الخلايا. طبق 1 × 106 خلايا في طبق 6 سم في اليوم -3.
  9. في اليوم 0 ، حصاد الخلايا وفصلها وعدادها. بذرة 1 × 105 - 1.5 × 105 خلايا iMOP في 0.5 مل من وسائط التمايز العصبية الدافئة مسبقا لكل بئر في طبق متعدد البئر 24. استنشق وأضف وسائط التمايز العصبية الدافئة مسبقا إلى الثقافات كل يوم.
  10. قم بإصلاح الخلايا العصبية المشتقة من iMOP في 4٪ فورمالديهايد لمدة 15 دقيقة في RT في اليوم 7. قم بإزالة محلول الفورمالديهايد ، واغسل الخلايا العصبية المشتقة من iMOP بمحلول غسيل (1X PBS يحتوي على 0.1٪ TritonX-100) قبل التحضين في المخزن المؤقت المانع (1X PBS يحتوي على 10٪ مصل ماعز عادي و 0.1٪ Triton X-100) لمدة ساعة واحدة.
    1. استبدل المخزن المؤقت واحتضان العينات في المخزن المؤقت المانع بجسم مضاد مخفف. احتضان عند 4 درجات مئوية. اغسل العينات باستخدام 1X PBS تحتوي على 0.1٪ Triton X-100 من الخلايا المعرضة للتلوين المناعي. اغسل الغطاء الزجاجي باستخدام 1X PBS قبل وضعه على وسائط التركيب. اترك وسائط التركيب تجف عند 4 درجات مئوية قبل الحصول على صور epifluorescence.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1.5 غطاء زجاجي بسمك (دائري 12 مم) علوم المجهر الإلكتروني 7 72230-01 DMEM / F12 تقنيات الحياة هاتف: 11320-082 الوسط العصبي القاعدي تقنيات الحياة هاتف: 21103 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) درجة الحموضة 7.4 تقنيات الحياة 10010-023 مكمل B27 (50X) خال من السيروم تقنيات الحياة 17504-044 مخزنة على شكل 1 مل من الحصص L-الجلوتامين (200 ملم) تقنيات الحياة هاتف: 25030-081 مخزنة على شكل 5 مل من الحصص لامينين الفأر الطبيعي تقنيات الحياة 23017-015 مخزنة على شكل 1 مجم / مل من الحصص إطالة الذهب المضاد للتلاشي تقنيات الحياة هاتف: 47743-736 مخزنة على شكل 10 مجم / مل 100 ميكرولتر من الكميات Moxi Z Mini عداد الخلايا الآلي أورفلو MXZ001 موكسي Z كاسيت نوع S أورفلو MXC002 بولي د-يسين سيغما P7886 يتم تعليقها في 1X PBS وتخزينها على شكل 10 مجم / مل 100 ميكرولتر 5 مل ماصة مغلفة بشكل فردي بغلاف ورقي (200/علبة) ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 1367811 د ماصة مغلفة بشكل فردي سعة 10 مل (200/علبة) ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 1367811 ه زراعة الأنسجة المعالجة بيوليت 24- لوحة جيدة ثيرمو فيشر العلمي 130188 زراعة الأنسجة المعالجة بيوليت 6- لوحة جيدة ثيرمو فيشر العلمي 130184 زراعة الأنسجة المعالجة صحن 6 سم ثيرمو فيشر العلمي 130181 EMD Millipore Millex حقنة معقمة PVDF تصفية حجم المسام: 0.22 ميكرومتر ثيرمو فيشر العلمي SLGV033RS TipOne أطراف ماصة مرشح 0.1 - 10 ميكرولتر طرف مرشح ممدود الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1120-3810 TipOne أطراف ماصة مرشح TipOne 1-20 ميكرولتر طرف مرشح الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1120-1810 TipOne أطراف ماصة مرشح 1 - 200 ميكرولتر طرف مرشح الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1120-8810 TipOne أطراف ماصة مرشح 101 - 1000 ميكرولتر طرف مرشح الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1126-7810 15 مل أنابيب مخروطية معقمة 20 كيس من 25 أنبوبا (500 أنبوب) الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1475-0511 50 مل أنابيب مخروطية معقمة 20 كيس من 25 أنبوب (500 أنبوب) الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1500-1211

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cdkn1b Tubb3

مقالات ذات صلة