تمت مراجعة جميع إجراءات النموذج الحيواني من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية وقام مجلس المراجعة البيطرية JoVE بمراجعة جميع إجراءات النماذج الحيوانية.
< ص الفئة = "jove_title" >
1. التزاوج في الوقت المناسب
- مكان ISLMN: GFP (بروتين الفلورسنت الأخضر العصبي الحركي للجزيرة. MGI: J: 132726; Jax Tg (Isl-EGFP *) 1SLP / J رقم المخزون: 017952) ذكور وإناث الفئران معا بين عشية وضحاها. قم بوزن الإناث وسجل الأوزان قبل التزاوج.
ملاحظة: ISLMN: يقوم GFP على وجه التحديد بتسمية الخلايا العصبية الحركية ب GFP farnesylated غير سام للخلايا ، ويتوطين في غشاء الخلية للخلايا العصبية الحركية ومحاورها ، ويسمح بتصور الأعصاب أثناء التطور. يمكن أيضا استخدام خطوط أخرى مصنفة بالفلورسنت.
- تحقق من وجود سدادات مهبلية في الصباح الباكر. يتم تعيين تاريخ تحديد القابس على أنه E0.5.
- تأكيد الحمل باستخدام زيادة الوزن و / أو الموجات فوق الصوتية في اليوم الجنيني 10.5 (E10.5). يجب أن تكتسب السدود الحامل 1 جم على الأقل. يمكن رؤية الأجنة بالموجات فوق الصوتية في E10.5.
< p class = "jove_title" >
2. تحضير الكواشف والاهتزاز لثقافة الشرائح
- تحضير 500 مل من محلول التقطيع: أضف 5 مل من HEPES (4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازين إيثان سلفونيك) و 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين إلى 500 مل من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) بدون Ca2+ و Mg2+. يبرد إلى 4 درجات مئوية < br / >
ملاحظه: يجب تخزين المخزن المؤقت الإضافي للتقطيع عند 4 درجات مئوية ويمكن استخدامه لتجارب زراعة الشرائح المستقبلية.
- تحضير 50 مل من وسائط الاستزراع: في غطاء معقم ، أضف 12.5 مل من HBSS ، و 12.5 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، و 250 ميكرولتر من الجلوكوز ، و 250 ميكرولتر من L-glutamine ، و 125 ميكرولتر من HEPES إلى 24.4 مل من Fluorobright DMEM (وسط النسر المعدل من Dulbecco). (التركيزات النهائية: FlouroBright DMEM مع 25٪ HBSS ، و 25٪ FBS ، و 0.5٪ جلوكوز ، و 1 ملي مولار من الجلوتامين ، و 2.5 ملي مولار HEPES.). قم بتسخين وسط الاستزراع إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي معقم.
ملاحظه: يمكن تخزين وسائط الاستزراع عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.
- في غطاء معقم ، أضف 1.5 مل من وسائط الثقافة إلى كل بئر من لوحة 6 آبار. أضف إدراج ثقافة الخلايا (جدول المواد) إلى كل بئر. ضعها في حاضنة معقمة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
- تحضير 4٪ من الاغاروز بدرجة حرارة انصهار منخفضة: قم بإذابة 2 جم من الاغاروز ذات درجة الذوبان المنخفضة في 50 مل من PBS المعقم. الميكروويف على فترات 30-60 ثانية حتى يذوب تماما. ضعه في حمام مائي 40 درجة مئوية للاحتفاظ بالسائل.
ملاحظه: يمكن تخزين agarose الإضافي في درجة حرارة الغرفة (RT) وصهره لتجارب زراعة الشرائح المستقبلية.
- إعداد الاهتزاز: ضع شفرة جديدة على الاهتزاز. تحقق من الإعدادات: سمك 400-450 ميكرومتر. قم بتبريد مرحلة الاهتزاز مسبقا. ضع بعض الثلج في الغرفة الخارجية. استخدم غرفة ومرحلة مخصصة للشرائح الحية. لا تستخدم نفس حجرة الاهتزاز للأنسجة الثابتة لأن المثبت المتبقي قد يضر بالشرائح.
- قم بإعداد الحاضنة العلوية لمرحلة المجهر إلى 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
- الاستعداد للتشريح: نظف الأدوات الجراحية ورشها بنسبة 70٪ من الإيثانول. املأ طبقين من بتري ب HBSS ، ضعه على الثلج. افتح لوح زراعة الأنسجة المكون من 12 بئر وضع الغطاء على الثلج بحيث يكون الجانب السفلي متجها لأعلى. افتح لوحة زراعة أنسجة 6 آبار وضع إدخالات غشاء زراعة الخلايا و 1.5 مل وسائط زراعة الخلايا في كل بئر. قم بتسخين الطبق مسبقا في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
< p class = "jove_title" >
3. حصاد الأجنة E10.5 وتحضير الشرائح
ملاحظة: يجب القيام بجميع الخطوات من هذه النقطة في أسرع وقت ممكن. احتفظ بالأجنة على الجليد في جميع الأوقات.
- القتل الرحيم للسد الحامل (E10.5) في غرفة ثاني أكسيد الكربون2. إجراء خلع عنق الرحم.
- رش البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. افتح البطن بالمقص ، وقم بإزالة الرحم وضعه في طبق بتري مع HBSS المثلج البارد لغسل الدم بسرعة. انقل الرحم المغسول إلى بتري ثان مليء بطبق HBSS المثلج.
- تحت نطاق تشريح ، قم بإزالة الأجنة من قرن الرحم والأكياس السلوية الفردية. ضع الأجنة على الجانب السفلي من غطاء صفيحة 12 بئر. ابق على الجليد.
- تحت نطاق التشريح ، استخدم ورق الترشيح لإزالة أي سائل يحيط بكل جنين.
ملاحظه: سوف تلتصق الأجنة بورق الترشيح إذا تم لمسها.
- تضمين الأجنة في الاغاروز. صب الاغاروز المذاب فوق كل جنين لتغطيته. ابق على الجليد. بمجرد أن يصلب الاغاروز ، اقلب كل جنين واسكب المزيد من الاغاروز على الجانب الآخر. ابق على الجليد.
- باستخدام نطاق تشريح الفلورسنت ، قم بقص الاغاروز حول كل جنين بحيث يتم توجيهه بشكل صحيح عند لصقه على مرحلة الاهتزاز. النواة الحركية للعين ونمو المحور العصبي المبكر هي الفلورسنت. قم بمحاذاة الجنين بحيث تشكل النواة والمحاور المتنامية والعين خطا ، وقم بقص الاغاروز بشفرة حلاقة مقطوعة بالتوازي مع هذا الخط (ظهرية للجنين ، انظر الشكل 1 أ).
ملاحظه: سيكون هذا هو الجانب اللاصق على مرحلة الاهتزاز (سيتم وضع الجنين على ظهره ، ورأسه الأقرب إلى شفرة الاهتزاز). يجب أن يكون الخط الفاصل بين النواة الحركية للعين والعين موازيا لشفرة الاهتزاز.
- املأ غرفة الاهتزاز بشريحة مثلجة باردة. قم بلصق الجنين بشكل كبير في مرحلة الاهتزاز بحيث تكون الشفرة موازية للنواة الحركية للعين والعينين. بمجرد أن يجف الغراء الفائق ، اغمر مرحلة الاهتزاز بحيث يتم توجيه الجنين بعيدا عن الشفرة.
- شريحة 400-450 ميكرومتر شرائح. اجمع كل شريحة باستخدام ماصة نقل معقمة. ضعها في محلول تقطيع بارد.
- تحت نطاق التشريح ، اختر الشريحة التي تحتوي على النوى الحركية للعين والعينين. باستخدام ماصة نقل معقمة ، ضعها على ملحق ثقافة الخلية في لوحة 6 آبار. أعد اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية. بدلا من ذلك ، اطلب من شخص واحد تقطيع الشرائح وآخر يضع الشرائح. قلل الوقت بين التقطيع ووضعه في الحاضنة.
ملاحظه: يجب توجيه الشرائح بطريقة تكون فيها الحد الأقصى للمضان المنبعث من النوى والمحاور أقرب إلى هدف مجهر التصوير. على المجهر المقلوب ، يجب وضع الشرائح على الغشاء مع وجود النوى والمحاور الأقرب إلى الهدف أسفل اللوحة.
- قم بإزالة الاغاروز المتبقي من مرحلة الاهتزاز ، وقم بلصق الجنين التالي على المسرح وكرر الخطوات 3.7-3.9 حتى يتم تقطيع جميع الأجنة وطلاءها.
- أضف مثبطا أو جزيئا مؤتلفا من اختيارك إلى الوسائط في كل بئر لإنشاء منحنى استجابة الجرعة. تمييع في المذيب المناسب.
ملاحظه: في حالة استخدام ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، استخدم DMSO فقط بدرجة زراعة الأنسجة. بدلا من ذلك ، يمكن وضع الخرزات المملوءة بالبروتين في مواقع محددة على الشريحة.
- ضعها على المجهر في غرفة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. اضبط المجهر لالتقاط صور تباين الطور والفلورسنت لكل شريحة كل 30 دقيقة (أو أكثر إذا رغبت في ذلك). يمكن الحفاظ على الشرائح لمدة 48-72 ساعة.
