عزل الخلايا العقدية الشبكية الفئرانية باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة

الملخص

المصدر: Chintalapudi, S. R., et al. عزل الخلايا العقدية الشبكية الأولية للفئران (RGCs) عن طريق قياس التدفق الخلوي. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو إجراء عزل خلايا العقدة الشبكية الأولية للفئران (RGCs) باستخدام قياس التدفق الخلوي. تسمح هذه الطريقة بالدراسة المستقبلية ل RGCs ، بهدف فهم أفضل للانخفاض الرئيسي في حدة البصر الناتج عن فقدان RGCs الوظيفية في الأمراض التنكسية العصبية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< p class = "jove_title" >1. إعداد الأدوات والحلول والوسائط

ملاحظة: يتم تحديد جميع المعلومات حول المواد والكواشف والأدوات والأدوات المبلغ عنها في البروتوكول في جدول المواد.

1. قم بالتعقيم بجميع أدوات التشريح وتخزينها في منطقة معقمة. استخدم الأدوات التالية: 4 ملقط قياسي (2 طويل و 2 قصير) و 2 مقص ، بالإضافة إلى ملقطين (1 طويل و 1 قصير) و 1 مقص للتشريح ؛ احتفظ بمجموعة إضافية كنسخة احتياطية.
2. قم بإعداد 100 مل من محلول الملح المعقم المعقم بالفوسفات (PBS) / 1٪ من مصل الأبقار الجنينية (FBS) لاستخدامه أثناء الغسيل وإجراءات وضع العلامات المناعية وخطوات فرز الخلايا. حافظ على المحلول مبردا عند 4 درجات مئوية < / > ملاحظه: لا تضيف أزيد الصوديوم (NaN₃) إلى المحلول ، لأنه يمكن أن يكون ساما للخلايا الحية.
   1. تحضير 100 مل من PBS / 1٪ FBS مع 99 مل من PBS و 1 مل من FBS.
3. قم بإعداد 100 مل من وسط الخلايا العصبية المعقمة المكمل بنسبة 3٪ FBS (انظر جدول المواد) لاستخدامها كوسيط تجميع واستزراع. حافظ على وسط زراعة الخلايا معقما عند 4 درجات مئوية. قم بتسخينه فقط إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام.
   1. تحضير 100 مل من وسط الخلية العصبية مع 3٪ FBS باستخدام 97 مل من وسط الخلية العصبية و 3 مل من FBS.
4. أنابيب تجميع ما قبل التبريد (أنابيب سعة 15 مل) مغلفة مسبقا ب 5 مل من وسط التجميع عن طريق وضعها في دلو ثلج. استخدم فقط أنابيب البولي بروبلين لمنع الخلايا من الالتصاق بسطح الأنبوب.
5. ضع أطباق مقاس 40 مم ، ومصافي نايلون 70 ميكرومتر ، ومحاقن ، ومدقات مصفاة الخلية ، وأنابيب البولي بروبلين المعقمة في خزانة السلامة الحيوية. تعقيم جميع العناصر قبل الإجراءات والحفاظ عليها بطريقة معقمة طوال الإجراءات.
   ملاحظه: سيتم تنفيذ جميع الخطوات بعد جمع شبكية العين في خزانة السلامة البيولوجية.

< p class = "jove_title" >2. تحضير تعليق خلايا الشبكية

1. ضع العين المجمعة على اللوحة الأساسية لمجهر التسلخ لبدء تشريح القرنية. تشريح كل عين على حدة.
2. أمسك الكرة الأرضية بعناية في قاعدة العصب البصري باستخدام الملقط. في هذه الخطوة ، استخدم ملقطا قياسيا طويلا وملقطا قصيرا.
3. استخدم إبرة حادة قياس 30 (30 جم) لثقب القرنية. سيسمح ذلك للفكاهة المائية بالتخلي من العين ، مما يسهل إمساك العين بالملقط.
4. أمسك القرنية بالملقط واستخدم المقص لعمل شق صغير في القرنية. قشر القرنية والصلبة برفق باستخدام الملقط. عندما يتم تقشير الكرة الأرضية في منتصف الطريق ، قم بلف شبكية العين والعدسة للخارج باستخدام الملقط. تخلص من القرنية والصلبة والعدسة.
   ملاحظه: تضمن هذه الطريقة انفصال الشبكية تماما عن بقية العين.
5. ضع شبكية العين في طبق بتري صغير مقاس 40 مم يحتوي على PBS / 1٪ FBS.
   ملاحظه: كبديل لطبق بتري ، يمكن استخدام طبق زراعة الخلايا. تأكد دائما من الحفاظ على رطوبة شبكية العين ، كما هو الحال في الظروف الفسيولوجية.
   1. اغسل كل شبكية العين ثلاث مرات باستخدام PBS / 1٪ FBS المعقم الطازج داخل خزانة السلامة الحيوية.
6. ضع ما يصل إلى 12 شبكية العين على مصفاة نايلون معقمة سعة 70 ميكرومتر مبللة ب PBS / 1٪ FBS. باستخدام الطرف الخلفي من حقنة سعة 10 مل ، نقع شبكية العين برفق باستخدام حركة دائرية لفصل الخلايا.
   1. بدلا من ذلك ، استخدم مدقة لنقع مصفاة الخلية أو استخدم الهضم الأنزيمي بمزيج من 15 وحدة دولية / مل من غراء ، و 5 ملي مولار L-cysteine ، و 200 U / mL DNase I لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، متبوعا بالتعطيل باستخدام PBS / 10٪ FBS.
      ملاحظه: لم يلاحظ أي تغييرات في النسبة المئوية للخلايا المستردة عند مقارنة الهضم الأنزيمي بالنقع إما بالطرف الخلفي للحقنة أو المدقة.
7. لنقل الخلايا المعزولة ، ضع مصفاة النايلون المعقمة 70 ميكرومتر فوق أنبوب تجميع البولي بروبلين. مرر الخلايا المجمعة عبر المصفاة باستخدام ماصة P1000. اشطف المصفاة (الخطوة 3.6) باستخدام PBS / 1٪ FBS لتحرير أي خلايا متبقية ونقلها إلى أنبوب التجميع.
8. أضف PBS / 1٪ FBS لتحقيق حجم نهائي يبلغ 1 مل لكل شبكية العين. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 7 دقائق عند 200 × جم و RT.
   ملاحظة: اعتمادا على عدد شبكية العين المتبللة (< 6 شبكية) ، قد تكون حبيبات الخلية صغيرة جدا بحيث لا يمكن رؤيتها.
   1. تخلص من المادة الطافية للخلية وأعد تعليق حبيبات الخلية في PBS / 1٪ FBS باستخدام نسبة 1 مل لكل 5 شبكية العين.
9. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
   1. نظف مقياس كثافة الدم الزجاجي والغطاء بالكحول بنسبة 70٪. قم بتدوير الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا برفق للتأكد من توزيع معلق خلية الشبكية بالتساوي. ضع 20 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان بلو في أنبوب طرد مركزي دقيق واخلطه مع 20 ميكرولتر من تعليق الخلية.
   2. امزج برفق وقم بتطبيق 10 ميكرولتر من مزيج التعليق الأزرق / الخلوي 0.4٪ على مقياس كثافة الدم ، واملأ كلتا الحجرتين ؛ سيؤدي العمل الشعري إلى سحب مزيج تعليق التريبان الأزرق / الخلية بنسبة 0.4٪ تحت الغطاء. باستخدام المجهر ، عد جميع خلايا التريبان الزرقاء السالبة. يمثل هذا الرقم الخلايا الحية.
   3. حدد صلاحية الخلية باستخدام الصيغة التالية: عدد الخلايا الحية / إجمالي عدد الخلايا = ٪ الجدوى.
      ملاحظه: إذا كانت صلاحية الخلايا أقل من 95٪ ، فستكون هناك حاجة إلى صبغة فلورية للتمييز بين بقاء الخلية أثناء فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS).
10. استخدم صبغة الفلورسنت القابلة للحياة غير المخصصة للخلايا الحية. اغسل الخلايا باستخدام PBS لإزالة أي أثر للمصل. أضف 1 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت لتمييز بقاء الخلية لكل 5.0 × 106 خلية في حجم نهائي 100 ميكرولتر. احتضن في RT لمدة 15 دقيقة ، محمية من الضوء. أضف 10 أضعاف حجم PBS / 1٪ FBS. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم و RT.
11. إذا لزم الأمر ، قم باحتضان معلق الخلية طوال الليل عند 4 درجات مئوية. إذا تم ذلك ، فاملأ أنبوب تعليق الخلية بوسط الخلية العصبية بدلا من PBS / 1٪ FBS. ضع الأنبوب أفقيا واحتفظ به عند 4 درجات مئوية.

< p class = "jove_title" >3. وضع العلامات المناعية على خلايا الشبكية

1. استخدم التحويل التالي لتحديد حجم الجسم المضاد لكل رقم خلية: 2 ميكرولتر من الجسم المضاد لكل 5.0 × 10⁶ خلايا في حجم 100 ميكرولتر.
2. اغسل الخلايا وحافظ عليها في PBS / 1٪ FBS. خذ حصة صغيرة من الخلايا (5.0 × 10⁶ خلايا) لاستخدامها كعنصر تحكم سلبي (غير مسمى) في وقت إعداد الفرز.
   ملاحظه: يعد هذا التحكم السلبي أمرا بالغ الأهمية للمعايرة المناسبة لفارز الخلايا.
3. لتقليل الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة بالخلايا التي تعبر عن مستقبلات Fcγ II و III ، أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد CD16 / 32 المضاد للفأر لكل 1.0 × 10⁶ خلايا في حجم نهائي 50 ميكرولتر باستخدام PBS / 1٪ FBS. احتضن لمدة 10 دقائق في RT.
4. أضف كوكتيل الأجسام المضادة إلى العينة واخلطه برفق عن طريق سحب العينات. احتضن لمدة 30 دقيقة في دلو ثلج. تأكد من تغطية دلو الثلج ، لأن الضوء قد يضر بالتجربة بسبب التبييض الضوئي للفلوروفورات الموسومة.
   1. قم بإعداد كوكتيل الأجسام المضادة باستخدام الأجسام المضادة للفأر التالية الموسومة بالفلورسنت: CD90.2 AF (Alexa fluor) -700 و CD48 PE (Phycoerythrin) -Cyanine7 و CD15 PE و CD57.
      غير الموسومة ملاحظة: لكل جسم مضاد ، استخدم التركيزات التالية لكل 5.0 × 10⁶ خلايا: CD90.2 AF700 ، 1 ميكروغرام ؛ CD48 PE-Cyanine7 ، 0.4 ميكروغرام ؛ CD15 PE ، 0.02 ميكروغرام ؛ و CD57 غير الموسومة ، 0.4 ميكروغرام.
      1. استخدم الأحجام وفقا للحسابات التالية (بناء على الأجسام المضادة المتاحة تجاريا المدرجة في جدول المواد): إجمالي 5.0 × 10⁷ خلايا ليتم تصنيفها ؛ 2 ميكرولتر لكل 5.0 × 10⁶ خلايا = 20 ميكرولتر من كل جسم مضاد ؛ 4 أجسام مضادة مختلفة = 80 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة ؛ الحجم النهائي = [(5.0 × 10⁷ خلايا إجمالية) / 5.0 × 10⁶ الخلايا] × 100 = 1,000 ميكرولتر ؛ 80 ميكرولتر ABS + 50 ميكرولتر من CD16 / 32 + 870 ميكرولتر PBS / 1٪ FBS = 1,000 ميكرولتر
         ملاحظه: قدم هذا المزيج المزيج الأمثل من الفلوروكرومات لتكوين الجهاز. تلخص المعلمات التالية الانبعاث والإثارة: AF-700 ، انبعاث 719 نانومتر عند الإثارة باستخدام ليزر الصمام الثنائي الأحمر 638 نانومتر. PE-Cyanine7 ، انبعاث 767 نانومتر عند الإثارة باستخدام ليزر الصمام الثنائي الأزرق 488 نانومتر ؛ و PE ، انبعاث 575 نانومتر عند الإثارة باستخدام ليزر الصمام الثنائي الأزرق 488 نانومتر.
5. بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة ، قم برفع الحجم إلى 5 مل باستخدام PBS / 1٪ FBS. اغسل العينات عن طريق الطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 200 × جم و RT. كرر الإجراء مرة واحدة لإزالة جميع الأجسام المضادة غير المرتبطة.
6. أضف 2 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي (0.1 ميكروغرام) ، والذي سيربط CD57 المكون من 5.0 × 106 خلية. احتضن لمدة 30 دقيقة في دلو ثلج ، كما في الخطوة 3.4. اغسل الخلايا مرتين ، كما في الخطوة 3.5.
   1. قم بتسمية الخلايا بجسم مضاد ثانوي إذا تم استخدام جسم مضاد أولي غير موسوم في الخطوة 3.4.
      ملاحظة: الجسم المضاد الثانوي المفضل لهذا التكوين مدرج في جدول المواد. يبلغ الطول الموجي للانبعاث 421 نانومتر. استخدمه مع مرشح ممر النطاق 450/50 نانومتر عند الإثارة باستخدام ليزر الصمام الثنائي البنفسجي عند 405 نانومتر.
   2. استخدم الأحجام وفقا للحسابات التالية (بناء على الجسم المضاد المتاح تجاريا المدرج في جدول المواد): 2 ميكرولتر لكل 5.0 × 10⁶ خلايا = 20 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي ؛ الحجم النهائي = [(5.0 × 10⁷ خلايا إجمالية) / 5.0 × 10⁶ خلايا] × 50 = 500 ميكرولتر ؛ 20 ميكرولتر من ABS + 480 ميكرولتر PBS / 1٪ FBS = 500 ميكرولتر.
7. احتفظ بالخلايا المسماة في PBS / 1٪ FBS. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ؛ استخدم تركيزا نهائيا لخلايا الشبكية من 3.0 - 4.0 × 10⁷ خلايا / مل < br / > ملاحظه: لا تستخدم وسط زراعة الخلايا لتخفيف الخلايا لأن الفينول الأحمر يمكن أن يزيد من التألق الذاتي ، وبالتالي تقليل الدقة بين الخلايا السالبة والموجبة. يعتمد تركيز الخلية النهائي لكل حجم بشكل كبير على معدل تدفق الحجم لتكوين الأداة.
8. استخدم عناصر التحكم أحادية اللون أثناء الإعداد لتقليل الانتشار الفلوري.
   ملاحظه: يتم تطبيق هذه الخطوة ، المعروفة أيضا باسم التعويض ، لتصحيح الضوضاء الناتجة عن مزيج الفلوروفورات. توفر الكريات المجهرية للبوليسترين في PBS / 0.1٪ BSA / 2 mM NaN3 مع القدرة على ربط الأنماط المتشابهة للجلوبولين المناعي (Ig) الموسومة بالفلورسنت من أنواع متعددة ضوابط إيجابية لضبط التعويض.
   1. ضع 3 قطرات من كريات البوليسترين المجهرية في أنابيب FACS معقمة ، مع تخصيص واحدة لكل فلوروفور. أضف 1 ميكروغرام من الفلوروفور المعني إلى كل أنبوب. احتضن لمدة 15 دقيقة في RT ، محمي من الضوء. أضف 3 مل من PBS / 1٪ FBS إلى أنابيب العينة. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم و RT. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليقها في 250 ميكرولتر من PBS / 1٪ FBS.
   2. لإعداد عناصر التحكم السلبية ، استخدم كريات البوليسترين المجهرية التي لا ترتبط ب Ig. إذا لزم الأمر ، قم بتنفيذ هذه الخطوة في اليوم السابق.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مضاد للفأر CD15 PE بيو ليجند 125606 استنساخ MC-480 مضاد للفأر CD48 PE-Cy7 بيو ليجند 103424 استنساخ HM48-1 مضاد للفأر CD57 سيجما ألدريتش C6680-100TST استنساخ VC1.1 مضاد للفأر CD90.2 AF700 بيو ليجند هاتف: 105320 استنساخ 30-H12 بريليانت البنفسجي 421 الماعز المضاد للفأر IgG بيو ليجند 405317 استنساخ Poly4053 منقى مضاد للفأر CD16 / 32 بيو ليجند 101302 كتلة FcgRII / III ، استنساخ 93 مصل الأبقار الجنينية هيكلون SH30071.03 من أصل أمريكي مجموعة حبة تعويض الأجسام المضادة الكلية ABC ثيرمو فيشر العلمي أ10497 متعدد الأنواع Ig الوسط العصبي القاعدي ثيرمو فيشر العلمي 21103049 أضف السيروم إلى الوسائط قبل المزرعة. محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثيرمو فيشر العلمي 10010049 محلول ملحي مجهر تشريح أوليمبوس نموذج SZ-PT مجهر ستيريو جهاز الطرد المركزي سورفال الترمو: العلمية ST 16R جميع عمليات الطرد المركزي التي يتم إجراؤها في RT لوحة القاعدة - مقلاة التشريح فيشر ساينتيك SB15233FIM يمكن أيضا استخدام صفيحة الشمع ملقط أسكولاب 5002-7 4 1/2 بوصة مقص قزحية ، مستقيم أسكولاب 1360 5 1/2 بوصة فالكون 15 مل أنابيب مخروطية الشكل فيشر ساينتيك 352097 أنابيب البولي بروبلين فالكون 50 مل أنابيب مخروطية الشكل فيشر ساينتيك 352098 أنابيب البولي بروبلين أنابيب BD FACS فيشر ساينتيك 352003 أنابيب البولي بروبلين أطباق 40 مم ميدسي TP93040 زراعة الأنسجة المعالجة مصفاة نايلون 70 ميكرومتر ميدسي 70 آي سي إس عقيم مصفاة نايلون 40 ميكرومتر ميدسي 40ICS عقيم حقنة 10 مل دينار بحريني فيشر ساينتيك 301604 حقنة يمكن التخلص منها بدون إبرة المدقة ميدسي الافات عقيم قوارير ويتون فيشر ساينتيك 986734 لا بطانة إبرة 30 جرام د.ب فيشر ساينتيك 305128 1 بوصة غرفة عد الزجاج العلمي من Hausser Scientific Bright-Line فيشر ساينتيك 0267151 ب مقياس الدم جيبكو تريبان أزرق 0.4٪ حل فيشر ساينتيك 15250061 صبغة الجدوى أنابيب Eppendorf فيشر ساينتيك 05-402-25 1.5 مل EVOS تصوير الخلايا الفليخية ثيرمو فيشر العلمي 447113 التصوير الفلوري بهدف 20x 100٪ إيثانول فيشر ساينتيك 04-355-452 تستخدم لصنع 70٪ إيثانول ماصة Pipet-Lite LTS L-1000XLS+ رينين 17014282 ماصة LTS ماصة LTS L-200XLS+ رينين 17014391 ماصة LTS ماصة LTS L-20XLS+ رينين 17014392 ماصة LTS حامل LTS 1000 مل - GPS-L1000S رينين 17005088 نصائح معقمة الرف الأزرق حامل LTS 250 مل – GPS-L250S رينين 17005092 نصائح معقمة الرف الأخضر رف LTS 20 مل - GPS-L10S رينين 17005090 نصائح معقمة الرف الأحمر فارز الخلايا FACSAria II BD Biosciences غير متاح طلب مخصص مقياس الخلايا LSR II BD Biosciences غير متاح طلب مخصص