$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
< ص فئة = "jove_content" >
ملاحظة: باختصار ، أعيد برمجة الخلايا الليفية إلى iPSC عبر إعادة البرمجة الجينية القائمة على mRNA. تم الحفاظ على iPSCs في وسط الخلايا الجذعية (SCM) (انظر قائمة المواد) وتخزينها بكثافة ~ 1.2 × 10
2 خلايا/مل مع 1 مل من SCM, 10 ميكرومتر مع مثبط كيناز البروتين المرتبط بrho (ROCKi) Y-27632, و 10٪ (V/V) كبريتيد ثنائي ميثيل (DMSO), في قوارير محفوظة بالتبريد في النيتروجين السائل عند -160 درجة مئوية. يتم تنفيذ جميع الإجراءات التالية أدناه في خزانة السلامة الحيوية ما لم ينص على خلاف ذلك.
فئة < p = "jove_title" >
1. تخفيف مصفوفة الغشاء القاعدي وطلاء الألواح
أدى - عامل النمو المخفف (1:50) إلى تقليل مصفوفة الغشاء القاعدي المنقاة من ورم Engelbreth-Holm-Swarm في Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) بدون الفينول الأحمر.
- قم بتغطية ألواح زراعة الخلايا بالكمية المناسبة من مصفوفة الغشاء القاعدي المخففة (على سبيل المثال ، صفيحة 6 آبار = 1 مل ، صفيحة 12 بئرا = 0.5 مل) واحتضان هذه الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل.
< ص الفئة = "jove_title" >
2. صيانة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC)
ملاحظة: الحد الأقصى للالتقاء لكل بئر في صفيحة مسطحة ذات 6 آبار هي ~ 1.2 × 106 خلايا.
- قم بإذابة iPSCs المحفوظة بالتبريد في SCM مع 10 ميكرومتر Y-27632 ولوحة على صفيحة 6 آبار مطلية بعامل نمو مخفف مخفف مصفوفة غشاء القاعد.
- الحفاظ على iPSCs في SCM مع 10 ميكرومتر Y-27632 لأول 24 ساعات بعد الذوبان. قم بالتبديل إلى الوسط الطازج بعد 24 ساعة.
- الحفاظ على iPSCs في SCM حتى تصل الخلايا إلى 80-90٪ التقاء قبل المرور.
- احسب كم عدد iPSCs ستكون مطلوبة للتمايز بضرب الكثافة المطلوبة للتمايز (15,600 خلايا/سم2) في مساحة سطح البئر. بالنسبة لصفيحة مسطحة القاع ذات 6 آبار ، اضرب 15,600 خلية / سم2 في 9.6 سم2 ليصبح المجموع 149,760 خلية / بئر.
- للمرور ، اغسل الخلايا بمحلول الملح المتوازن من هانكس (HBBS). بعد ذلك ، احتضان الخلايا بحمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك غير الأنزيمي (EDTA) (انظر قائمة المواد) لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- استخدم مكشطة خلية لرفع الخلايا برفق. اجمع الخلايا في SCM الجديد.
- قم بوضع خلايا صفيحة على ألواح زراعة الخلايا المغلفة ب SCM المخفف وحافظ على الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.3 أو قم بتخزينها عند ~ 1.2 × 106 خلايا / مل في 1 مل من SCM و 10 ميكرومتر Y-27632 و 10٪ DMSO (v / v) في قوارير محفوظة بالتبريد في النيتروجين السائل عند درجة حرارة -160 درجة مئوية.
< p class = "jove_title" >
3. التمايز بين iPSCs إلى BMECs
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: يفصل EDTA غير الأنزيمي الخلايا إلى كتل. يفصل EDTA الأنزيمي (انظر
جدول المواد) الخلايا إلى معلق خلية واحدة. يجب حماية حمض الريتينويك (RA) من الضوء.
- اغسل iPSCs مرة واحدة باستخدام محلول ملحي عازل للفوسفات (DPBS) من Dulbecco. احتضان مع EDTA الأنزيمي (1 مل للوحة 6 آبار ، 0.5 مل للوحة 12 بئرا ، و 0.25 مل للوحة 24 بئرا) لمدة 5 دقائق تقريبا عند 37 درجة مئوية لإنتاج تعليق خلية واحدة.
- اجمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم (قوة الطرد المركزي النسبية) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق كريات الخلايا في SCM التي تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632.
- حدد كثافة الخلايا باستخدام Trypan Blue وعداد الخلايا الآلي أو جهاز مقياس الدم. خلايا صفيحية بكثافة 15,600 خلية / سم2 أو 149,760 خلية / بئر من صفيحة مسطحة القاع مكونة من 6 آبار (بمساحة سطح 9.6 سم 2 / بئر) في SCM تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 لمدة 24 ساعة.
- بدء التمايز بعد 24 ساعة عن طريق تغيير SCM إلى وسيط E6. قم بتغيير E6 متوسط يوميا لمدة 4 أيام قادمة.
- في اليوم 4 من التمايز ، استبدل وسط E6 بوسط خال من مصل البطاني البشري (hESFM) مكمل بمكمل B27 المخفف (1: 200) ، و 20 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) ، و 10 ميكرومتر RA. لا تقم بتغيير هذا الوسيط لمدة 48 ساعة.
- تحضير 200 مل من hESFM مع B27 المخفف (1:200) ، امزج 1 مل من مكمل B27 المركز 50x إلى 199 مل من hESFM.
- قم بإعداد 20 نانوغرام / مل من bFGF عن طريق إعادة تكوين 50 ميكروغرام من bFGF في 250 ميكرولتر من محلول تريس (5 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 7.6 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، كلوريد الصوديوم) لصنع محلول مخزون 200 ميكروغرام / مل. تحضير 200 مل من hESFM تحتوي على 20 نانوغرام / مل bFGF عن طريق خلط 20 ميكرولتر من 200 ميكروغرام / مل bFGF مع 200 مل من hESFM.
- قم بإعداد 10 ميكرومتر من RA عن طريق صنع 40 مجم / مل من محلول مخزون RA أولا عن طريق إضافة 2.5 مل من DMSO إلى 100 مجم من مسحوق RA. خفف هذا التركيز إلى 3 مجم / مل لعمل محلول مخزون 10 ملم. قم بإعداد 200 مل من hESFM الذي يحتوي على 10 ميكرومتر RA عن طريق خلط 200 ميكرولتر من 10 ميكرومتر RA في 200 مل hESFM.
< ص الفئة = "jove_title" >
4. طلاء الكولاجين الرابع (COL4) والفيبرونيكتين (FN) مصفوفة لتنقية BMEC المشتق من iPSC
- أضف 2 مل من الماء المعقم إلى 2 مجم من FN لعمل 1 مجم / مل من محلول مخزون FN. أضف 5 مل من الماء المعقم إلى 5 مجم من COL4 لعمل محلول مخزون COL4 1 مجم / مل.
- اترك FN يذوب لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية ويذوب COL4 في درجة حرارة الغرفة.
- تمييع محلول مخزون FN في ماء معقم إلى تركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام / مل ومحلول مخزون COL4 إلى تركيز نهائي قدره 400 ميكروغرام / مل.
- قم بتغطية الألواح المرغوبة (صفيحة 6 آبار = 1 مل من محلول COL4 / FN ، لوح 12 بئرا = 0.5 مل ، صفيحة 24 بئرا = 0.25 مل ، ولوحة مصفاة 12 بئر = 0.25 مل) بمزيج من 400 ميكروغرام / مل COL4 و 100 ميكروغرام / مل FN.
- احتضان الألواح لمدة لا تقل عن ساعتين أو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ؛ بالنسبة لألواح Transwell المفلترة ، يوصى ب 4 ساعات على الأقل.
< p class = "jove_title" >
5. الاستزراع الفرعي وتنقية BMECs المشتقة من iPSC
ملاحظة: قد يستغرق الحضانة باستخدام EDTA الأنزيمي أكثر من 15 دقيقة اعتمادا على التقاء الخلايا في اليوم 6 من التمايز.
- في اليوم السادس من التمايز ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام DPBS. احتضان ب 1 مل من EDTA الأنزيمي لمدة 15 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية حتى يتم الحصول على معلق خلية واحدة.
- اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق كريات الخلايا باستخدام hESFM الطازج مع مكمل B27 المخفف (1: 200) ، و 20 نانوغرام / مل bFGF ، و 10 ميكرومتر RA.
- خلايا البذور على ألواح مغلفة بمزيج من 400 ميكروغرام / مل COL4 و 100 ميكروغرام / مل FN. خلايا البذور باستخدام نسبة 1 بئر من صفيحة 6 آبار إلى 3 آبار من صفيحة 12 بئرا ، أو 3 آبار من صفيحة مصفاة 12 بئرا ، أو 6 آبار من صفيحة 24 بئرا.