$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. إعداد المواد
- احتضان بيض الكتاكيت في حاضنة بيض منضدية متوفرة تجاريا عند 37 درجة مئوية. احتضن البيض لمدة 7 أيام لأجنة E7.
- إعداد مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية (MEAs). قم بتعقيم العدد المطلوب من الإيثانول عن طريق نقعها في 70٪ من الإيثانول لمدة 3 إلى 4 ساعات ثم شطفها ثلاث مرات في حوالي 10 مل من الماء المقطر المعقم في غطاء السلامة البيولوجية من المستوى الثاني (BSLII><).
ملاحظه: تحتوي MEAs على 64 قطبا كهربائيا من البلاتين النانوي مسامي مرتبة في شبكة 8 × 8. يبلغ قطر القطب 30 ميكرومتر، والتباعد بين الأقطاب الكهربائية 200 ميكرومتر. لا تستخدم الإيثانول المشوه لتعقيم الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف ، لأن ذلك سيؤدي إلى التآكل.
- ضع MEAs داخل وعاء معقم بغطاء (للحفاظ على الظروف المعقمة) وانتقل إلى حاضنة منضدية. اخبزيها لمدة 6 ساعات على الأقل عند 55 درجة مئوية. هذه الخطوة ضرورية للتعقيم المناسب ، ويجب ألا تتجاوز درجة الحرارة 60 درجة مئوية. للحفاظ على العقم ، انقل الطبق الذي يحتوي على MEAs إلى غطاء BSLII للتخزين حتى الاستخدام الآخر.
ملاحظه: نستخدم طبق خبز زجاجي آمن للفرن بغطاء بلاستيكي ونقوم بتعقيمه ب 70٪ من الإيثانول ونضعه في غطاء BSLII للتجفيف.
- Aliquot من محلول المصفوفة خارج الخلية (ECM). قم بإذابة القارورة عند 4 درجات مئوية طوال الليل وتجميد 100 ميكرولتر من الحصص عند -20 درجة مئوية
ملاحظه: يتم شحن ECM مجمدة. لا ينبغي إحضاره إلى درجة حرارة الغرفة حتى يصبح جاهزا للطلاء لأنه يتبلمر في درجة حرارة الغرفة ومن المستحيل تغطيته بمجرد بلمرته. يفضل ECM بدون عوامل النمو لمنع التأثيرات الإضافية بسبب عوامل غير معروفة.
قم - بتعقيم جميع أدوات التشريح (ملقط Dumont # 5 ، والملقط المنحني ، والمقص الصغير ، والمقص الزنبركي) وأطباق التشريح المطلية بالمواد ذاتية الغلق مع 70٪ من الإيثانول واتركها تجف في غطاء التشريح.
< p class = "jove_title" >
2. ثقافة الخلايا العصبية الجنينية للكتكوت ونشاط الشبكة
- في يوم الطلاء ، قم بإزالة قارورة ECM من الفريزر -20 درجة مئوية ، ورشها بنسبة 70٪ إيثانول ، وضعها على الثلج. خفف إلى 25٪ عن طريق إضافة 300 ميكرولتر من الوسط العصبي القاعدي البارد داخل غطاء محرك BSLII.
- باستخدام ماصة P200، أضف 100 ميكرولتر من 25٪ ECM إلى مركز MEA مع الحرص على عدم لمس الأقطاب الكهربائية وإزالتها على الفور مع ترك طبقة رقيقة على السطح. غطي MEA وضعه في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 (37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2) حتى يصبح جاهزا لطلاء الخلايا العصبية.
- تعقيم القشرة الخارجية لبويضة E7 (اليوم الجنيني 7 ، محتضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام) مع 70٪ إيثانول. اقطع رأس الجنين في طبق تشريح قاع سيلجارد يحتوي على محلول أملاح هانك المتوازن المعقم البارد (HBSS) بدون الكالسيوم. قطع حول العينين وإزالة مقل العيون. باستخدام ملقط DuMont # 5 الناعم والمقص الزنبركي ، قم بعمل شق على الجانب البطني وإزالة الطبقات الخارجية من الجلد لفضح الدماغ الأمامي والأذن البصرية. قشر وإزالة غشاء البيال بعناية. انقل الدماغ الأمامي إلى طبق بتري آخر وقطعه إلى قطع صغيرة حوالي 2 مم بمقص زنبركي.
ملاحظه: يجب ألا يكون هناك أي أوعية دموية متصلة بالدماغ الأمامي بعد إزالة غشاء اللحوم. إذا كان ذلك متاحا ، فمن الأفضل إجراء التشريح في غطاء تشريح معقم ، على الرغم من أننا حصلنا على نتائج جيدة إلى حد ما عند إجراء التشريح خارج غطاء المحرك طالما أن الأدوات ومنطقة التشريح معقمة تماما بنسبة 70٪ من الإيثانول.
- باستخدام ماصة نقل معقمة ، اجمع قطع الدماغ الأمامي في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من HBSS بعد تركها تغرق في قاع أنبوب الطرد المركزي.
- أضف 1 مل من 0.05٪ تريبسين / حمض إيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (التربسين / EDTA) (دافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية) واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- باستخدام ماصة باستور ، قم بإزالة التربسين بعناية دون إزعاج قطع الأنسجة وأضف 1 مل من الوسط العصبي القاعدي. دع قطع الأنسجة تغرق في القاع وقم بإزالة الوسط. كرر هذا الغسيل مرة أخرى. هذه الخطوة هي غسل التربسين / EDTA.
- أضف 2 مل من الوسط العصبي القاعدي وابدأ في الترتيبات. يتضمن الاختبار أخذ ماصة باستور معقمة مصقولة بالنار وتمرير الأنسجة برفق من خلالها عدة مرات حتى لا ترى المزيد من القطع. إذا بقيت أي قطع بعد التمريرات المتكررة ، فما عليك سوى تركها لتستقر في الأسفل.
ملاحظه: تجنب الرغوة أثناء التجربة - إذا تشكلت الرغوة ، فتوقف وقم بإزالتها عن طريق الشفط.
- قم بتخفيف الخلايا المعاد تعليقها بنسبة 1:10 بوسط عصبي القاعدي وعد الخلايا القابلة للحياة باستخدام صبغة Trypan Blue ومقياس كثافة الدم. امزج 50 ميكرولتر من الخلايا المخففة مع 50 ميكرولتر من محلول Trypan Blue في أنبوب طرد مركزي سعة 0.5 مل. أضف 10 ميكرولتر إلى مقياس الدم بعد وضعه على الغطاء وعد الخلايا الصافية الساطعة (الخلايا الزرقاء ميتة ولا ينبغي عدها).
ملاحظه: تتراوح أعداد الخلايا النموذجية من تكتوم بصري E7 واحد بين 1 و 5 × 107 خلايا / مل.
- قم بوضع الخلايا المنفصلة على MEAs المطلية ب ECM بكثافة 2,200 خلية / مم مربع. بالنسبة لنظام MEA الخاص بنا ، يترجم هذا إلى ما يقرب من 130,000 خلية لكل MEA. أضف الوسط العصبي القاعدي لرفع الحجم في MEA إلى 1 مل ووضع MEAs في حاضنة CO2 طوال الليل لربط الخلية وتمديد العصبية (الشكل 1).
ملاحظه: بالنسبة للمناطق المتوسطية والمتوسطة ذات المناطق المختلفة وأعداد الأقطاب الكهربائية ، يمكن تجربة كثافات مختلفة للخلايا - بشكل عام ، تؤدي كثافة الخلايا العالية إلى نشاط أكبر للشبكة ، ولكنها تؤدي أيضا إلى ثقافات أقصر عمرا.
