توليد رقاقة حاجز الدم الدماغي باستخدام الخلايا السليفة المشتقة من iPSC

الملخص

المصدر: Jagadeesan ، S. ، وآخرون ، جيل من شريحة الحاجز الدموي الدماغي البشرية القائمة على iPSC. J. Vis. Exp. (2020).

< p class = "jove_content">يعرض هذا الفيديو إنشاء شريحة حاجز دموي دماغي باستخدام خلايا السلائف المشتقة من iPSC. يتضمن زرع الخلايا السلفية العصبية والخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ في قنوات منفصلة بغشاء مسامي. من خلال تدفق وسائط التمايز ، تشكل الخلايا البطانية تقاطعات ضيقة تشبه الأوعية الدموية ، وتنضج الخلايا العصبية في أنواع مختلفة من خلايا الدماغ ، مما يؤدي إلى إنشاء حاجز دموي دماغي وظيفي على الشريحة.

البروتوكول

فئة < ص = "jove_title" >1. توليد الخلايا السلفية العصبية المشتقة من iPSC (iNPCs)

1. إنتاج مجالات EZ من مستعمرات iPSC كما هو موضح أدناه وكما نشرت سابقا.
   1. استزراع مستعمرات iPSC إلى التقاء على مصفوفة الغشاء القاعدي المغلفة 6 ألواح الآبار (0.5 ملغ/لوحة) في mTESR1 أو غيرها من الوسائط التجارية (انظر جدول المواد).
   2. قم بإزالة وسيط iPSC واستبدله ب 2 مل من وسط EZ-sphere [ESM; DMEM: F12 7: 3 مكمل ب 100 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) ، 100 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة ، 5 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، و 2٪ مكمل B27].
   3. اكشط الجزء السفلي من كل بئر ملتقى بالجزء الخلفي من طرف ماصة معقم سعة 1000 ميكرولتر أو مكشطة خلوية.
   4. اجمع جميع الخلايا وضعها في قارورة T25 منخفضة للغاية للسماح بالتكوين التلقائي للكرات العائمة بحرية. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
   5. قم بتغذية الكرات كل 2-3 أيام عندما يتحول لون الوسط إلى اللون الأصفر عن طريق استبدال نصف الوسط ب ESM الطازج. هذا يسمح للكرات بالبقاء في وسط مكيف ، وهو أمر مهم للغاية لنموها وصيانتها.
      1. اتكئ القارورة على رف أنبوبي واترك الكرات تستقر عن طريق الجاذبية لمدة 1-2 دقيقة وصولا إلى زاوية القارورة.
      2. بمجرد استقراره، استنشق نصف المادة الطافية بماصة مصلية سعة 5 مل أو 10 مل واستبدلها ب ESM طازج ودافئ مسبقا.
   6. قم بتمرير المجالات EZ أسبوعيا عن طريق تقطيع الكرات إلى أقطار 200 ميكرومتر كما هو موضح سابقا. يمكن الحفاظ على المجالات EZ لما يصل إلى 25 ممرا وهي مثالية عند استخدامها بين الممرات من 8 إلى 25.
2. إعداد تعليق خلية واحدة من iNPCs:
   1. للحث على التمايز العصبي ، قم بفصل الكرة EZ إلى خلايا مفردة.
   2. اجمع الكرات بعد 3-4 أيام من التقطيع من قارورة T75 وانقلها إلى شكل مخروطي سعة 15 مل ، ثم اتركها لمدة دقيقتين أو حتى تستقر جميع الكرات في الأسفل.
   3. قم بإزالة ESM ببطء باستخدام ماصة سعة 5 مل دون تعطيل الكرات المستقرة. أضف 1 مل من محلول التفكك (انظر جدول المواد) واحتضنه لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
   4. قم بتدوير محلول التفكك والكرات بعد 5 دقائق من الحضانة للتأكد من معالجة أي كرات مستقرة.
   5. قم بإزالة محلول التفكك ببطء. أضف 1 مل من وسط التمايز العصبي [NDM; DMEM: F12 مع 2٪ B27 ناقص فيتامين أ ، مكمل N2 1٪ ، وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ البشري (hBDNF ، 20 نانوغرام / مل)].
   6. قم بتقطيع الكرات إلى خلايا مفردة عن طريق سحب العينات باستخدام ماصة سعة 1 مل متبوعة بماصة سعة 200 ميكرولتر، حتى تنفصل جميع المجالات. تجنب تكوين الفقاعات أثناء إجراء التكليف.
   7. عد الخلايا المنفصلة باستخدام مقياس كثافة الدم وتخفيف الخلايا إلى كثافة نهائية تبلغ 1 × 10⁶ خلايا / مل. من الممكن تغيير الكثافة حسب التطبيق.
      ملاحظه: يوصى بكثافة أعلى (حتى 6 × 10⁶ خلايا / مل) للثقافات قصيرة المدى لمدة تصل إلى 3 أيام ، ويوصى بكثافة أقل للتطبيقات طويلة المدى لمدة تصل إلى 3 أسابيع.
      ملاحظه: الخلايا جاهزة الآن للبذر في القناة العلوية للشريحة لتشكيل "جانب الدماغ".

< p class = "jove_title" >2. تمايز iPSCs إلى iBMECs

1. ممر iPSCs من بئر واحد ملتقى من لوحة 6 آبار في 1:6 نسبة إلى 6 آبار غشاء القاعدة المغلفة صفصفة صفيحة. دع الخلايا تلتصق لمدة 24 ساعة. تغيير وسيط iPSC يوميا.
2. عد الخلايا يوميا باستخدام مقياس كثافة الدم.
3. عندما تصل الخلايا إلى كثافة 1.5-3.0 × 105 خلايا/بئر, استبدال وسيط iPSC مع 3 مل من الوسط غير المشروط دون bFGF [DMEM:F12 1:1, مع 10٪ استبدال مصل خروج المغلوب (KOSR), 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA), 0.5٪ مكمل الجلوتامين (جدول المواد), و 100 ميكرومتر β-ميركابتو إيثانول]. استبدل المتوسط يوميا لمدة 6 أيام.
4. في اليوم 6 ، استبدل الوسط بوسط الخلايا البطانية (EC) [وسط خال من مصل البطان البشري (hESFM) مكمل بمصل بقري مشتق من البلازما بنسبة 1٪ ، و 20 نانوغرام / مل bFGF ، و 10 ميكرومتر حمض الريتينويك المتحول بالكامل (RA)]. اتركيه متوسطا لمدة 2 أيام.
5. قم بإزالة وسط EC وأضف 1 مل من محلول التفكك لكل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 35 دقيقة < / > ملاحظه: في حين أن هذا يعتبر وقتا طويلا للحضانة في محلول التفكك المستخدم هنا ، يمكن أن تتحمل iBMECs هذا العلاج مع بقاء الخلية أعلى من 90٪.
6. افصل الخلايا عن البئر عن طريق سحب تعليق الخلية برفق وجمع جميع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
   ملاحظه: تجنب سحب العينات القاسية. إذا لم تنفصل الخلايا بسهولة ، فقم باحتضانها لمدة 5 دقائق إضافية.
7. أضف حجما واحدا من وسط EC إلى 15 مل مخروطي الشكل لتعطيل Accutase ، وجهاز الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة الوسط ، واستبدله ب 1 مل من وسط EC (بدون bFGF و RA).
8. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم واضبط كثافة الخلايا إلى 14-20 × 10⁶ خلايا / مل
   ملاحظه: الخلايا جاهزة الآن للزرع في القناة السفلية للرقاقة لتشكيل "جانب الدم".

فئة

3. التصنيع الدقيق لشريحة الجهاز

1. استخدم شريحة عضو لنموذج شريحة BBB وإنتاجها كما تم سابقا. يتم تصنيع رقاقة عضو القناة الطويلة (انظر جدول المواد) من مطاط مطاطي عالي المرونة من بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS) يحتوي على قناتين متراكبتين ومتوازيتين مفصولتين بغشاء مسامي مرن. أحجام القنوات الدقيقة العلوية والسفلية هي 1 مم × 1 مم و 1.0 مم × 0.2 مم ، على التوالي. يتم فصل القناتين عن طريق غشاء مسامي مرن بسمك 50 ميكرومتر مصنوع من PDMS ، يحتوي على مسام قطرها 7 ميكرومتر مع تباعد 40 ميكرومتر. تبلغ مساحة سطح الغشاء المسامي الذي يفصل بين القنوات 0.171 سم².

< p class = "jove_title" >4. إعداد الرقاقة

1. يتم توفير رقائق الأعضاء معبأة مسبقا داخل حامل الشريحة ، مما يلغي الحاجة إلى إزعاج أو تشويه محاذاة الرقاقة أثناء المناولة. بالإضافة إلى ذلك ، يتصل حامل الشريحة بشكل آمن بوحدة محمولة ("Pod") تعمل كواجهة بين وحدة الثقافة والرقاقة.
   1. رش عبوة الرقائق بنسبة 70٪ من الإيثانول وأدخلها إلى خزانة السلامة الحيوية (BSC).
   2. افتح العبوة وضع شريحة الأعضاء في طبق بتري معقم. تعامل مع حامل الرقائق فقط من الجانبين لتجنب الاتصال المباشر بالشريحة.
   3. تأكد من أن علامة تبويب الناقل تواجه اليمين (الشكل 1) ، وعند استخدام رقائق متعددة ، قم بمحاذاة كل منها في نفس الاتجاه.
   4. قم بتسمية كل شريحة في علامة تبويب الناقل (يتم عرض إعداد الشريحة بالكامل وسير العمل في الشكل 2).

فئة

5. تنشيط السطح وطلاء ECM

1. تحضير محلول تنشيط السطح
   1. كاشف محاكاة 1 (ER-1) ، المقدم في قارورة تحتوي على 5 مجم ، حساس للضوء. قم بإعداد محلول ER-1 الطازج مباشرة قبل الاستخدام. تعد سلامة ER-1 أمرا بالغ الأهمية في التحضير الناجح للرقائق.
   2. أطفئ الضوء في BSC عند التعامل مع ER-1.
      ملاحظه: ER-1 مهيج للعين ويجب التعامل معه في BSC باستخدام القفازات المناسبة وحماية العين.
   3. اسمح لكواشف ER-1 و ER-2 بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام.
   4. احم المحلول من الضوء عن طريق لف أنبوب مخروطي معقم فارغ سعة 15 مل بورق الألمنيوم.
   5. في BSC ، اضغط لفترة وجيزة على قارورة ER-1 لتسوية المسحوق في الأسفل.
   6. أضف 1 مل من المخزن المؤقت ER-2 إلى القارورة ، وانقل محتواها على الفور إلى قاع الأنبوب المخروطي الملفوف سعة 15 مل. لا تقم بالماصة للخلط. سيكون لون المحلول المنقول إلى الأنبوب المخروطي أحمر.
   7. كرر الخطوة 5.1.6 3x. في الجولة الأخيرة ، قم بتغطية قارورة ER-1 واقلبها لجمع أي مسحوق متبقي من الغطاء ، ثم انقل المحلول إلى الأنبوب المخروطي ؛ سيؤدي ذلك إلى رفع الحجم الإجمالي إلى 4 مل من محلول ER-1.
   8. أضف 6 مل من محلول ER-2 إلى 4 مل من محلول ER-1 في الأنبوب المخروطي سعة 15 مل إلى تركيز نهائي قدره 0.5 مجم / مل. يجب إذابة ER-1 بالكامل داخل محلول ER-2.
2. تنشيط Surface
   1. باستخدام ماصة P200 وطرف ماصة معقمة مفلترة سعة 200 ميكرولتر، تمتص 200 ميكرولتر من خليط ER-1.
   2. ضع الماصة في المدخل السفلي وادفع 20 ميكرولتر من خليط ER-1 عبر القناة السفلية حتى يبدأ الخليط في التدفق من مخرج القناة السفلية.
   3. أضف ما يقرب من 50 ميكرولتر من خليط ER-1 وضعه في مدخل القناة العلوي. ادفع الخليط عبر القناة العلوية حتى يبدأ في التدفق من مخرج القناة العلوية.
   4. قم بإزالة كل خليط ER-1 الزائد من سطح الرقاقة عن طريق الشفط اللطيف. تأكد من إزالة خليط ER-1 فقط من سطح الرقاقة وليس من القنوات.
   5. تحقق من خلو القنوات من فقاعات الهواء قبل تنشيط الأشعة فوق البنفسجية (UV). إذا تم الكشف عن فقاعات هواء ، فقم بإزالة الفقاعات عن طريق غسل القناة بخليط ER-1.
   6. ضع الطبق المفتوح الذي يحتوي على الرقائق في صندوق ضوء الأشعة فوق البنفسجية (المقدم من شركة Emulate Inc.).
   7. اضبط المفتاح الموجود في الجزء الخلفي من صندوق ضوء الأشعة فوق البنفسجية على إعداد "متسق". قم بتشغيل الطاقة وبدء تنشيط الأشعة فوق البنفسجية. اترك الرقائق تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة < / > ملاحظه: تجنب تعرض الأفراد للأشعة فوق البنفسجية.
   8. قم بإزالة خليط ER-1 من كلتا القناتين.
   9. اغسل كل قناة ب 200 ميكرولتر من محلول ER-2.
   10. قم بإزالة ER-2 من كلتا القناتين.
   11. اغسل كل قناة ب 200 ميكرولتر من محلول ملحي معقم بارد مخزن بالفوسفات (DPBS).
   12. اترك DPBS باردا داخل القنوات حتى الانتقال إلى الخطوة التالية.
3. تحضير وطلاء المصفوفة خارج الخلية (ECM)
   1. قم بإعداد محلول ECM عن طريق الجمع بين مكونات ECM الفردية مع DPBS البارد أو الماء أو أي مذيب آخر إلى تركيزات العمل النهائية. يجب تحضير محلول ECM طازجا في كل مرة يتم استخدامه.
   2. قم بتغطية كل من القنوات العلوية والسفلية للرقاقة ب ECM ، مع التركيب على النحو الذي يحدده نوع الخلية المراد زرعها. يجب حفظ خليط ECM على الثلج حتى الاستخدام.
   3. استخدم اللامينين (50 ميكروغرام / مل) لتغطية "جانب الدماغ" ، وخلط الكولاجين الرابع والفيبرونيكتين بنسبة 4: 1 (320: 80 ميكروغرام / مل) لتغطية "جانب الدم" كما هو موضح في القسم 5.6.
4. تحضير حصصات ECM
   1. تمييع 1 ملغم/مل لامينين في DPBS بارد إلى تركيز نهائي قدره 50 ميكروغرام/مل. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
   2. قم بإذابة الكولاجين الوريدي في 0.1٪ حمض الأسيتيك بتركيز 1 مجم / مل. احتضان المحلول عند 2-8 درجة مئوية طوال الليل أو عند RT لمدة 1-3 ساعات أو حتى يذوب تماما.
   3. تحضير خليط 1 مل من الكولاجين الرابع: فيبرونيكتين (320 ميكرولتر من الكولاجين الرابع ، 80 ميكرولتر من الفيبرونكتين ، 600 ميكرولتر من H2O المقطر المزدوج المعقم). يمكن تخزين الخليط عند -20 درجة مئوية.
5. طلاء الرقائق ب ECM
   1. استنشق DPBS البارد بالكامل من كلتا القناتين. اضبط ماصة P200 لامتصاص 100 ميكرولتر من محلول الكولاجين IV: فيبرونيكتين.
   2. أدخل المحلول من خلال مدخل القناة السفلية حتى تتشكل قطرة صغيرة على المخرج. اترك قطرة صغيرة على المدخل بعد إزالة طرف الماصة.
   3. أدخل محلول اللامينين من خلال مدخل القناة العلوي حتى تتشكل قطرة صغيرة على المخرج. اترك قطرة صغيرة على المدخل بعد إزالة طرف الماصة.
   4. انظر عن كثب إلى القنوات للتأكد من عدم وجود فقاعات. في حالة وجود فقاعات، اغسل القناة بمحلول ECM المناسب حتى تتم إزالة جميع الفقاعات.
   5. كرر الخطوات 5.5.1–5.5.4 لكل شريحة.
   6. أضف 1.5 مل من DPBS إلى غطاء أنبوب مخروطي سعة 15 مل. ضع غطاء DPBS في طبق الاستزراع مقاس 150 مم مع الرقائق لتوفير رطوبة إضافية وإغلاق الطبق بالبارافيلم للحصول على أفضل النتائج ، احتضن الرقائق عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
      ملاحظه: إذا رغبت في ذلك ، يمكن زرع الخلايا في نفس يوم تنشيط الرقاقة وطلاء ECM ، على الرغم من تفضيل الحضانة بين عشية وضحاها. يمكن أن تكون الرقائق جاهزة للبذر لمدة 4 ساعات بعد إضافة ECM واحتضان الرقائق عند 37 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >6. بذر قناة "جانب الدماغ" وتمييز مجالات EZ إلى ثقافات عصبية مختلطة

1. أحضر الطبق الذي يحتوي على الرقائق المحضرة إلى BSC. اغسل كلتا القناتين برفق باستخدام 200 ميكرولتر من NDM.
2. تجنب ملامسة المنافذ ، قم بشفط قطرات الوسائط الزائدة بعناية من سطح الشريحة. حرك تعليق الخلية برفق قبل بذر كل شريحة لضمان تعليق خلوي متجانس
3. زرع iNPCs في القناة العلوية لتوليد "جانب الدماغ"
   1. قم بزرع الخلايا (1 × 106 خلية / مل) في القناة العلوية للشريحة. أضف طرف P200 يحتوي على 30-100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى مدخل القناة العلوي وحرر الطرف برفق من الماصة. خذ ماصة P200 فارغة، واضغط على المكبس، وأدخلها في مخرج القناة العلوية، واسحب نظام التعليق أحادي الخلية بعناية عبر الشريحة.
   2. قم بتغطية الطبق وانقله إلى المجهر للتحقق من كثافة البذر والتوزيع المتجانس للخلايا داخل القناة العلوية. قم بإزالة طرف الماصة برفق من منافذ مدخل ومخرج الرقائق.
   3. يجب أن تظهر كثافة البذر على أنها تغطية بنسبة 20٪. إذا كانت كثافة البذر أعلى أو أقل من المتوقع أو غير متساوية ، فأعد الرقائق إلى BSC ، واغسل القناة 2x ب 200 ميكرولتر من الوسط الطازج ، وكرر الخطوة 6.3.1.
   4. بعد التأكد من كثافة الخلية الصحيحة ، ضع الرقائق على الفور في الحاضنة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية بعد بذر كل دفعة من الرقائق. اغسل الخلايا التي لا تعلق على NDM الطازج.
   5. الحفاظ على الخلايا في ظروف ثابتة عند 37 درجة مئوية مع استبدال NDM يوميا لمدة لا تقل عن 48 ساعة قبل بدء التدفق. يمكن زرع iBMECs بعد ربط iNPCs أو في يوم لاحق بعد بذر iNPC.

< p class = "jove_title" >7. بذر iBMECs في القناة السفلية لتوليد "جانب الدم"

1. أحضر الطبق الذي يحتوي على الرقائق المحضرة إلى BSC. اغسل القناة السفلية برفق باستخدام 200 ميكرولتر من وسط EC.
2. تجنب ملامسة المنافذ ، قم بشفط قطرات من وسط EC الزائد بعناية من سطح الشريحة ، مع التأكد من ترك وسيط في كلتا القناتين. حرك تعليق الخلية برفق قبل بذر كل شريحة لضمان تعليق خلوي متجانس.
3. باستخدام ماصة P200، ارسم 30-100 ميكرولتر من معلق الخلية iBMEC (14-20 ×^{10 6} خلايا/مل) وضع الطرف في مدخل القناة السفلية. افصل الطرف برفق عن الماصة، واترك الطرف المحتوي على الخلية في منفذ المدخل.
4. اضغط على المكبس الموجود على ماصة P200 بطرف فارغ، وأدخله في مخرج القناة السفلية، واسحب نظام التعليق أحادي الخلية بعناية عبر القناة السفلية عن طريق تحرير مكبس الماصة ببطء.
5. استنشاق تعليق الخلية الزائدة من سطح الشريحة. تجنب الاتصال المباشر بمنافذ المدخل والمخرج لضمان عدم سحب تعليق الخلية من القنوات.
6. قم بتغطية الرقاقة ونقلها إلى المجهر لمراقبة كثافة البذر. يجب ملء القناة السفلية بعدم وجود فجوات يمكن ملاحظتها بين الخلايا عند ملاحظتها عند 4x أو 10x تحت المجهر (الشكل 3).
7. إذا كانت كثافة البذر أقل من 90٪ من التغطية أو موزعة بشكل غير متساو ، فاضبط كثافة الخلية وفقا لذلك وكرر الخطوات 7.2-7.6 حتى يتم تحقيق الكثافة الصحيحة داخل القناة. بعد التأكد من كثافة الخلايا الصحيحة (الشكل 3) ، خلايا البذور في الرقائق المتبقية. لربط الخلايا بالغشاء المسامي ، الموجود في الجزء العلوي من القناة السفلية ، اقلب كل شريحة واستقر في مهد رقاقة.
8. ضع خزانا صغيرا (غطاء أنبوب مخروطي الشكل سعة 15 مل يحتوي على DPBS معقم) داخل الطبق مقاس 150 مم لتوفير الرطوبة للخلايا. احتضان الرقائق عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات تقريبا ، أو حتى يتم توصيل الخلايا الموجودة في القناة السفلية. بمجرد توصيل iBMECs (~ 3 ساعات بعد البذر) ، اقلب الرقائق مرة أخرى إلى وضع رأسي للسماح بربط الخلية بالجزء السفلي من القناة السفلية.

8. بدء التدفق

1. يبدأ التدفق عادة بعد 48 ساعة من بذر iBMECs. هذه المرة مطلوبة حتى تعلق iBMECs بإحكام على الشريحة.
2. للحفاظ على التدفق الرقائقي عبر الرقاقة ، من المهم تفريغ درجة حرارة الوسط وموازنتها. يجب تسخين الوسط مسبقا في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
3. يمكن تفريغ ما يصل إلى 50 مل من الوسط الدافئ عن طريق الحضانة تحت نظام ترشيح يعمل بالفراغ لمدة 15 دقيقة.
4. فتيلة الوحدات المحمولة
   1. قم بتعقيم الجزء الخارجي من عبوة الوحدات المحمولة والصواني بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وامسحها ونقلها إلى BSC. افتح العبوة وضع الوحدات في الدرج. قم بتوجيههم بالخزانات باتجاه الجزء الخلفي من الدرج.
   2. ماصة 3 مل من الوسائط الدافئة المتوازنة مسبقا لكل خزان مدخل. أضف وسط استزراع EC إلى خزان مدخل القناة السفلية و NDM إلى خزان مدخل القناة العلوية للقناة العلوية (الشكل 4).
   3. الماصة 300 ميكرولتر من الوسائط الدافئة المتوازنة مسبقا لكل خزان مخرج ، مباشرة فوق كل منفذ منفذ (الشكل 4).
   4. ضع ما يصل إلى ست وحدات محمولة على كل درج. أحضر الصواني إلى الحاضنة وحركها بالكامل في وحدة الاستزراع بحيث يكون مقبض الدرج متجها للخارج.
   5. حدد دورة "Prime" وقم بتشغيلها على وحدة الثقافة. أغلق باب الحاضنة واسمح لوحدة الثقافة بتجهيز الوحدات المحمولة (يستغرق ~ 1 دقيقة). تكتمل دورة التحضير عندما يقرأ شريط الحالة "جاهز". قم بإزالة الدرج من وحدة الاستزراع وإحضاره إلى BSC.
   6. تحقق من أن الوحدات المحمولة قد تم تحضيرها بنجاح عن طريق فحص الجانب السفلي لكل وحدة محمولة في BSC. ابحث عن وجود قطرات صغيرة في جميع المنافذ الأربعة.
      1. إذا كانت أي وحدة نمطية محمولة لا تظهر قطرات، فأعد تشغيل الدورة الأولية على هذه الوحدات النمطية. إذا تقطت أي وسائط على الدرج (قد يحدث هذا في كثير من الأحيان بواسطة منافذ المخرج) ، فقم بتنظيف الدرج بنسبة 70٪ من الإيثانول.
5. توصيل الرقائق بالوحدات المحمولة ، والتنظيم ، وبدء التدفق
   1. اغسل كلتا القناتين من كل شريحة برفق باستخدام وسيط ثقافة دافئ ومتوازن خاص بالخلية لإزالة أي فقاعات محتملة في القناة ووضع قطرات صغيرة من الوسائط (وفقا للوسائط الموجودة في القناة) في الجزء العلوي من كل منفذ مدخل ومخرج.
   2. أدخل الرقائق مع الناقلات في الوحدات المحمولة وضع ما يصل إلى ستة على كل درج. أدخل الصواني في وحدة الثقافة. قم ببرمجة ظروف زراعة رقاقة الأعضاء المناسبة (معدل التدفق والتمدد) على وحدة الاستزراع.
   3. ستبدأ الشروط المبرمجة بمجرد اكتمال دورة "التنظيم".
      ملاحظه: يمكن التحكم في معدلات التدفق لكل قناة بشكل مستقل ويمكن ضبطها على معدلات تتراوح من 0 إلى 1,000 ميكرولتر / ساعة. عادة ما يتم زراعة شريحة BBB بسرعة 30 ميكرولتر / ساعة. عند تدفق الوسائط مثل وسائط EC أو ESM عند 30 ميكرولتر / ساعة و 1000 ميكرولتر / ساعة ، تكون قوى القص 0.01 دين/سم² و 0.33 دين/سم² على التوالي.
   4. قم بتشغيل دورة "التنظيم" ، والتي تستغرق حوالي 2 ساعة ، وبعد ذلك ستبدأ وحدة الاستزراع في التدفق في ظروف زراعة رقاقة الأعضاء المحددة مسبقا.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تخطيطي للعرض العلوي للشريحة في حامل الشريحة ، مع منافذ مسماة.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2: مخطط انسيابي لإعداد رقاقة BBB المستندة إلى iPSC وسير العمل. مطلوب التمايز المسبق لكل من الخلايا العصبية والبطانية من iPSCs قبل بدء سير العمل. <...

المواد