$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. التشريح المجهري Telencephalon الظهري الجانبي
- تحضير وسط التشريح (100 مل): 98.5 مل محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) ، 0.5 مل 5 م 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازين إيثان سلفونيك حمض (HEPES) درجة الحموضة 7.4 ، 1 مل بنسلين / ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل و 10,000 ميكروغرام / مل).
- قم بتصفية وتعقيم وسط التشريح.
- إزالة أجنة اليوم الجنيني 14 (E14) من فأر حامل C57 / Bl6 (Mus musculus) تحت التخدير مع isoflurane.
ملاحظه: ضع في اعتبارك E0 كيوم اكتشاف السدادات المهبلية. يجب أن يكتمل التشريح في موعد لا يتجاوز 1 ساعة بعد إزالته من الفأر الحامل. ينطبق هذا البروتوكول أيضا على الأجنة E11-E17.
- إزالة الأجنة عن طريق استئصال الرحم في ظروف معقمة.
- انقل الأجنة إلى طبق بتري بوسط تشريح بارد (4 درجات مئوية).
- قم بإزالة الأدمغة من الجمجمة عن طريق قطع الشق الطولي. عادة ما يتراوح عدد الأجنة من خمسة إلى عشرة. ينتج كل دماغ E14 ما يقرب من 2 × 106 خلايا ، بما في ذلك الأسلاف والخلايا العصبية بعد الانقسام (نسبة 1: 1) < br / >
ملاحظه: استخدم المجهر المجسم للخطوات التالية.
- قم بإزالة السحايا باستخدام ملقط التشريح. قم بتقسيم telencephalon في المنتصف لفصل نصفي الكرة الأرضية. لعزل الدماغ الظهري الوحشي ، قم بقص المنحنى الظهري والحدود السطحية الفرعية باستخدام ملقط التشريح. انقل الدماغ الظهري الجانبي إلى أنبوب سعة 2 مل مع وسط تشريح بارد (4 درجات مئوية) حتى يتم تشريح جميع الأدمغة.
< p class = "jove_title" >
2. تفكك الخلية والطلاء
- تحضير وسط التكاثر (50 مل من DMEM+ 10٪ FCS): 44 مل من Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) ، 5 مل مصل عجل الجنين (FCS) ، 0.5 مل 40٪ جلوكوز ، 0.5 مل بنسلين / ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل و 10,000 ميكروغرام / مل). تعقيم وسط الانتشار بتصفية
- تحضير وسط التمايز (50 مل من DMEM + 2٪ B27): 48 مل DMEM ، 1 مل B27 ، 0.5 مل 40٪ جلوكوز ، 0.5 مل بنسلين / ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل و 10,000 ميكروغرام / مل). تعقيم وسط التمايز بتصفية
- بعد التشريح الدقيق للدماغية الظهرية الجانبية من الفئران E14 ، قم بالطرد المركزي للأنبوب بالأنسجة المجمعة ووسط التشريح البارد (لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، 340 × جم) لترسيب الأنسجة.
- قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة وأضف 1 مل من حمض التربسين-إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) (0.05٪) للهضم الكيميائي. احتضن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أضف 2 مل من وسط التكاثر لإيقاف نشاط التربسين.
- قم بتلميع طرف ماصة باستور الزجاجية فوق موقد غاز أو موقد بنسن لبضع ثوان لتضييق الفتحة قليلا. اغسل الماصة عن طريق شفط FCS لتغطية طرفها. لتجنب الفقاعات، قم بفصل الخلايا ميكانيكيا باستخدام ماصة باستور مصقولة بالنار ومغلفة ب FCS.
- الطرد المركزي للخلايا (لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، 340 × جم). قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة. أضف 1 مل من وسط التكاثر وأعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
- قم بإعداد تخفيف 1: 1 لتعليق الخلية باستخدام محلول Trypan Blue بنسبة 0.4٪. ستكون الخلايا غير القابلة للحياة زرقاء. باستخدام غرفة Neubauer ، احسب عدد الخلايا القابلة للحياة (غير الملوثة).
- خفف الخلايا في وسط تكاثر للحصول على 106 خلايا / مل. أضف 500 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا (حوالي 2.5 × 105 خلايا / سم2). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
ملاحظه: لا تستخدم أغطية زجاجية ، حيث يمكن أن تتحرك أثناء التجربة وتغير مجال المراقبة. بدلا من ذلك ، استخدم ألواح زراعة الأنسجة ذات القاع الزجاجي.
ملاحظه: إذا كنت لا تستخدم أطباق متعددة المعالجة بزراعة الخلايا ، فمن المهم معالجة أطباقك مسبقا باستخدام Poly-D-Lysin (50 ميكروغرام / مل) لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.