إنشاء ثقافة خلايا العقد الجذرية الجذرية الأولية من العمود الفقري للفئران

الملخص

المصدر: Lin، Y.، et al. عزل العقد الجذرية الظهرية والثقافة الأولية لدراسة إطلاق الناقل العصبي. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تقنية لعزل واستزراع خلايا العقد الجذرية الظهرية (DRG) من العمود الفقري للفئران. يتم التعامل مع DRGs المستخرجة من العمود الفقري بالإنزيمات وفصلها ميكانيكيا للحصول على تعليق أحادي الخلية. يتم زراعة الخلايا في وسط يحتوي على مثبطات وعوامل نمو تحد من تكاثر الخلايا الدبقية وتعزز نمو الخلايا العصبية ، على التوالي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. اجمع DRG القطني من الفئران التجريبية

1. استخدم فئران Sprague-Dawley (SD) البالغة من العمر 2 إلى 3 أسابيع لجمع DRG القطني.
   ملاحظة: الخلايا العصبية DRG التي تم جمعها من الفئران التي تزيد أعمارها عن 4 أسابيع لا تنمو بشكل جيد في ظل ظروف الثقافة الموضحة هنا.
2. تعقيم جميع الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف.
3. قم بتخدير الجرذ بمزيج 1: 1 من التيتامين والزولازيبام (20 مجم / كجم ؛ الحقن داخل الصفاق (IP)) وانتظر حتى يظهر عدم إظهار أي استجابة لسحب القدم في اختبار قرصة إصبع القدم.
   ملاحظه: يمكن استخدام استراتيجيات التخدير المختلفة بنجاح في هذا البروتوكول.
4. التضحية بالجرذ بقطع الرأس بمقصلة تجارية.
5. استخدم المقصلة لعزل جذع جسم الفئران بين الطرف الأمامي وعظم الفخذ. انظر الشكل 1 أ للحصول على رسم تخطيطي للمنطقة المراد جمعها.
   ملاحظه: يجب أن يكون خط القطع الذيلي مجرد منقاري لعظم الفخذ. سيتم استئصال أسفل الظهر L6 DRG إذا كان موقع القطع مرتفعا جدا في العمود الفقري.
6. اقطع على طول القص وقم بإزالة جميع الأعضاء / الأنسجة بمقص التشريح (الشكل 2 أ أ).
7. قطع على طول جانب الجذع لجمع الجزء الظهري من الفئران وإزالة الجلد. انظر الشكل 1 ب للحصول على صورة للجذع الظهري المقطع.
8. تحضير الأنسجة على الجليد قبل جمع DRG. نظف الفراء والدم من القفازات وعقمهما بنسبة 75٪ من الإيثانول قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
9. إزالة العضلات التي تغطي العمود الفقري القطني. أولا ، قم بعمل قطعتين على جانبي العمود الفقري (اليسار واليمين) وقطع جانبي واحد لتحديد المدى المنقاري للعمود الفقري القطني. ثم قم بإزالة العضلات الظهرية للعمود الفقري باستخدام ملقط قطع العظام (الشكل 2 أ-ب).
10. قم بإزالة الجزء الظهري من الفقرات باستخدام ملقط قطع العظام وفضح الحبل الشوكي.
11. قم بإزالة الحبل الشوكي بمقص التشريح (الشكل 2A-c) والملقط (الشكل 2A-d).
12. حدد DRG القطني عن طريق عد الفقرات من الضلع الأخير (الفقرة الصدرية 13). انظر الشكل 1C للحصول على رسم تخطيطي لمواضع الفقرات.
13. اجمع DRG القطني الثنائي (L1-L6) بمقص دقيق (الشكل 2A-f) في طبق استزراع مقاس 35 مم مع 2 مل وسط خال من المصل المثلج. قم بإزالة الألياف العصبية (كما هو موضح في الشكل 1C) من توصيل DRG ، ثم انقلها إلى طبق الثقافة لتحسين نقاء الثقافات.
    ملاحظه: يمكن الاحتفاظ ب DRG المجمعة في وسط على الجليد لمدة 1 ساعة تقريبا. وفي الوقت نفسه ، يمكن قتل العديد من الفئران الرحيم لإنشاء مجموعة أكبر من DRG.

2. الثقافة الأولية لأخشاب الفئران DRG

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية في غطاء التدفق الرقائقي.

1. تحضير وسط استزراع يحتوي على 10٪ مصل بقري للجنين ، و 100 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و 1x بنسلين / ستربتومايسين في 1x DMEM-F12.
2. قم بتغطية الصفيحة المعالجة بزراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا ب 200 ميكروغرام / مل بولي إل ليسين لمدة ساعتين ثم اغسلها بالماء المعقم.
قم
3. باحتضان طبق الثقافة مسبقا بوسط ثقافة 1 مل في حاضنة 37 درجة مئوية_CO2 قبل الاستخدام لمدة 30 دقيقة على الأقل.
4. انقل الطبق المكون من 35 مم المكون من DRG إلى غطاء رقائقي واغسل DRG بوسط خال من المصل 3 مرات بواسطة الماصة.
   ملاحظه: يجب تنظيف الجزء الخارجي من الطبق بنسبة 75٪ من الإيثانول قبل نقله إلى الغطاء. يمكن أن يحتوي الطبق مقاس 35 مم على DRG من عدد من الفئران (سيعتمد ذلك على متطلبات التصميم التجريبي).
5. انقل DRG (من فأر واحد أو مدمج من فئران متعددة) إلى طبق استزراع جديد مقاس 35 مم ، والذي يحتوي على 2 مل من نوع الكولاجيناز IA (1 مجم / مل في وسط خال من المصل) مع ملاقط معقمة (الشكل 2A-e).
   ملاحظه: يجب تعقيم محلول الكولاجيناز عن طريق تمريره عبر مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
6. هضم DRG في محلول الكولاجيناز في حاضنة 37 درجة مئوية CO₂ لمدة 30 دقيقة.
7. قم بإزالة محلول الكولاجيناز وغسل DRG 3 مرات في 2 مل من محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS).
   ملاحظه: قد تكون هناك ألياف أو أنسجة متبقية تخرج من DRG في المحلول. قم بإزالتها بواسطة الماصة بمحلول الغسيل.
8. أضف 2 مل 0.05٪ تريبسين EDTA مسخن مسبقا إلى طبق 35 مم المحتوي على DRG وهضم DRG في حاضنة 37 درجة مئوية CO₂ لمدة 30 دقيقة.
9. انقل 2 مل من المحلول المحتوي على DRG إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل بواسطة ماصة زجاجية.
   ملاحظه: قد تلتصق DRG بالماصة الزجاجية ، لذا يجب تنفيذ هذه الخطوة بعناية. يمكن تجنب فقدان DRG عن طريق الاحتفاظ بالمحلول المحتوي على DRG في الطرف المدبب للماصة الزجاجية (حوالي 0.5 مل) ونقل المحلول إلى أنبوب الطرد المركزي ببطء ولكن دون توقف.
10. قم بالطرد المركزي للمحلول عند 290 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وأضف وسيطا آخر خال من المصل سعة 2 مل لإعادة تعليق DRG.
11. كرر الخطوة 2.10 مرتين ولكن قم بتغيير الوسط الخالي من المصل إلى وسط الثقافة الدافئ مسبقا في المرة الأخيرة.
12. قم بترتيبات DRG يدويا 60 مرة تقريبا باستخدام ماصة باستور مصقولة باللهب (الطول 230 مم والقطر الداخلي لرأس الطرف 1 مم). انظر الشكل 2 ب للحصول على صورة فوتوغرافية تقارن فتحة ماصة باستور المصقولة باللهب بماصة غير مصقولة.
    ملاحظه: القطر الداخلي لماصة باستور المصقولة باللهب أصغر بنسبة 10٪ تقريبا من ماصة التحكم، ويجب أن يكون الجزء الداخلي من الطرف المدبب أكثر سلاسة. احرص على عدم تكوين فقاعات عند خلية الخلايا.
13. قم بإزالة الطبق المغطى بالبولي إل ليسين من حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂. استنشق وسط الثقافة المحتضن من الطبق وبذر الخلايا المنفصلة في الطبق المغطى.
14. قم بزرع خلايا DRG من فأر واحد (مجموعة ثنائية من L1-L6 ، مقابل 12 DRG إجماليا) في أربعة آبار من صفيحة 24 بئرا ؛ هناك ما يقرب من 5 × 10⁴ خلايا في بئر واحد من صفيحة 24 ب><ئرا. ملاحظه: هذه الكثافة مناسبة للتلوين المناعي. لاستخراج اللطخة الغربية أو الحمض النووي الريبي ، قم بزرع خلايا DRG من فأر واحد (ثنائي L1-L6) في بئر واحد من صفيحة 6 آبار.
15. استبدل وسط الاستزراع في اليوم التالي بإضافة 10 ميكرومتر سيتارابين (Ara-C) و 100 نانوغرام / مل NGF وقم بتحديث الوسط كل يومين بعد ذلك.
    ملاحظه: يمكن أيضا زراعة DRG الصدري من خلال هذا البروتوكول ، إذا تم جمعها من العمود الفقري الصدري.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: مخططات معالجة الأنسجة. يتم جمع DRG القطني من الفئران البالغة من العمر 3 أسابيع. (أ) يشار إلى المواضع التي يجب أن تستخدم فيها المقصلة لقطع بخطوط منقطة. (ب) يظهر الجذع الظهري مع إزالة الجلد و (ج) مواقع DRG القطنية (من L1-L6). يمثل الملحق DRG والألياف المتصلة (المشار إليها بالأسهم).

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خليط من التيتامين والزولازيبام (زوليتيل) فيرباك زولتيل 50 التخدير مصل الأبقار الجنينية الصناعات البيولوجية 04-001-1 وسط الثقافة بيروفات الصوديوم سيغما إس 8636 وسط الثقافة البنسلين / الستربتومايسين الصناعات البيولوجية 03-033-1 وسط الثقافة DMEM-F12 إنفيتروجين 12400024 وسط الثقافة بولي أنا يسين سيغما ص 9011 طبق طلاء كولاجيناز IA سيغما 9001-12-1 هضم الإنزيم محلول الملح المتوازن من هانك إنفيتروجين 14170-112 وسط الثقافة تريبسين EDTA الصناعات البيولوجية 03-051-5 هضم الإنزيم ماصة باستور هيلجنبرغ 3150102 خلية التخلي سيتارابين (Ara-C) سيغما سي 6645 وسط الثقافة NGF ميليبور NC011 وسط الثقافة