إصابة الخلايا العصبية الأولية للفأر في الدماغ المتوسط بفيروسات هندسية مرتبطة بالغدة

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Bancroft ، E. A. ، et al. ، القياس الكمي التلقائي للتدفقات Ca²⁺ وآثارها النهائية في الخلايا العصبية الأولية للفأر في منتصف الدماغ. J. Vis. Exp. (2020).

يظهر هذا الفيديو إصابة الخلايا العصبية الأولية في الدماغ المتوسط للفأر بالفيروسات المرتبطة بالغدة التي تحمل مؤشر الكالسيوم الفلوري. يؤكد تألق المؤشر العدوى الناجحة ويتيح المراقبة في الوقت الفعلي للعدوى العصبية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

ملاحظة: يجب تحضير محاليل زراعة الخلايا باستخدام إجراءات معقمة في خزانة السلامة البيولوجية وتصفيتها عند 0.2 ميكرومتر لمنع التلوث.

1. إعداد الحلول ووسيط الثقافة

1. تحضير محلول طلاء اللامينين عن طريق تخفيف 20 ميكرولتر من 1 مجم / مل من مخزون اللامينين إلى 2 مل من H₂
O.
2. قم بإعداد محلول توقف مصل الخيول (الحصان) بنسبة 10٪ عن طريق إضافة 5 مل من ES إلى 45 مل من محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS). فلتر معقم باستخدام نظام مرشح 0.2 ميكرومتر أو طرف مرشح حقنة. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
3. قم بإعداد محلول مخزون مصل الألبومين البقري بنسبة 4٪ (BSA) عن طريق إضافة 2 جم من مسحوق BSA إلى 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وجعله يصل إلى الحجم النهائي البالغ 45 مل. فلتر معقم باستخدام نظام مرشح 0.2 ميكرومتر أو طرف مرشح حقنة. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
4. تحضير محلول مرق غراء عن طريق تخفيف غراء إلى 3 مجم / مل في 1x HBSS. فلتر معقم باستخدام نظام مرشح 0.2 ميكرومتر أو طرف مرشح حقنة. يحفظ في -20 درجة مئوية.
5. قم بإعداد محلول ديوكسيربونوكلياز (DNase) عن طريق إضافة 20 مجم من مسحوق DNase إلى H₂O المعقم والوصول إلى الحجم النهائي البالغ 20 مل. فلتر معقم باستخدام نظام مرشح 0.2 ميكرومتر أو طرف مرشح حقنة. يحفظ في -20 درجة مئوية.
6. قم بإعداد محلول مخزون حمض الأسكوربيك عن طريق إضافة 352 مجم من حمض الأسكوربيك إلى H2O المقطر المعقم والوصول إلى الحجم النهائي البالغ 20 مل. إذا لزم الأمر ، سخنيها في حمام 37 درجة مئوية حتى تذوب. فلتر معقم باستخدام نظام مرشح 0.2 ميكرومتر أو طرف مرشح حقنة. يحفظ في -20 درجة مئوية.
7. تحضير وسط زراعة الخلايا عن طريق إضافة ما يلي إلى 50 مل من الوسط العصبي القاعدي: 500 ميكرولتر من الجلوتاماكس (100x) ، 500 ميكرولتر مصل الخيول ، 1 مل من B-27 ، 100 ميكرولتر من حمض الأسكوربيك ، 500 ميكرولتر من البنسلين الستربتومايسين ، 50 ميكرولتر من الكاناميسين و 50 ميكرولتر من الأمبيسلين. مرشح معقم باستخدام نظام تصفية 0.2 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
8. قم بإعداد محلول Triton X-100 بنسبة 0.01٪ عن طريق إضافة 1 مل من Triton X-100 إلى 9 مل من 1x PBS لعمل محلول 10٪. نظرا لأن Triton X-100 لزجة، فقم بفك الماصة ببطء للسماح للطرف بالامتلاء تماما. يسخن في حمام 37 درجة مئوية ليذوب إذا لزم الأمر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
9. لتخفيف 10٪ من مخزون Triton X-100 إلى 0.01٪ ، قم بإجراء 3 تخفيفات تسلسلية 1:10. قم بتخفيف 1 مل من المخزون بنسبة 10٪ إلى 9 مل من 1x PBS لعمل محلول 1٪. خفف 1 مل من محلول 1٪ إلى 9 مل من 1x PBS لعمل محلول 0.1٪. قم بتخفيف 1 مل من محلول 0.1٪ إلى 9 مل من 1x PBS لعمل محلول 0.01٪.
10. قم بإعداد 10٪ و 1٪ من محاليل مصل الماعز العادي (NGS) عن طريق إضافة 1 مل من NGS إلى 9 مل من 1x PBS لمحلول 10٪ و 100 ميكرولتر من NGS إلى 9.9 مل من 1x PBS لعمل محلول 1٪.
11. تحضير محلول مخزون الغلوتامات (100 مل) عن طريق إضافة 735 مجم من حمض الجلوتاميك L (+) إلى H2O المقطر المعقم والوصول إلى الحجم النهائي البالغ 50 مل. ستكون الذوبان في هذا التركيز مشكلة. إضافة كميات صغيرة (100 ميكرولتر) من حمض الهيدروكلوريك 1 M كافية لزيادة الذوبان.
12. قم بإعداد محلول مخزون NBQX (10 مل) عن طريق إضافة 50 مجم من NBQX إلى H₂O المقطر المعقم والوصول إلى الحجم النهائي البالغ 13 مل.

< ص الفئة = "jove_title" >2. تحضير أطباق الثقافة والأغطية (تم في اليوم السابق للتشريح)

ملاحظة: لقد وجدنا أن الجمع بين ثلاثة عوامل طلاء ، بولي إل ليسين ، بولي إل أورنيثين ، ولامينين ، يسمح بالتصاق الخلية المثالية وقابليتها للحياة.

1. ضع أطباق بتري مقاس 10 35 مم في خزانة السلامة البيولوجية. ضع غطاءين دائريين مقاس 12 مم في كل طبق واملأه بنسبة 70٪ EtOH لمدة 10 دقائق. استخدم خطا مفرغا لشفط EtOH المتبقي من كل طبق ، مما يسمح ل EtOH بالتبخر تماما.
2. الماصة ~ 90-100 ميكرولتر من محلول بولي ليسين 0.1٪ على كل غطاء ، مع التأكد من تغطية الغطاء بالكامل. غطي الأطباق بأغطية وضعيها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
3. استنشق محلول بولي إل ليسين المتبقي من كل غطاء وشطفه ب H₂O المعقم.
4. كرر الخطوات 2.2 - 2.3 مع محلول بولي إل أورنيثين 0.1٪.
5. مرة أخرى ، كرر الخطوات 2.2 - 2.3 مع محلول لامينين 0.01٪. ضعها في حاضنة 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ حتى تصبح جاهزة لطلاء الخلايا في اليوم التالي.

< p class = "jove_title" >3. تشريح الفأر الجنيني

ملاحظة: نستخدم ما بين 4 إلى 6 فئران حامل موقوتة لكل مزرعة. في حين أن الكثير من عملية التشريح تحدث خارج خزانة السلامة البيولوجية ، إلا أنه لا يزال من المهم الحفاظ على إجراء معقم. يعد الاستخدام الوفير ل 70٪ EtOH على الأسطح القريبة من مجهر التسلخ وعلى الأدوات الجراحية مثاليا. يمكن أيضا ارتداء قناع أثناء التشريح لمنع التلوث بشكل أكبر. بالإضافة إلى ذلك ، نستخدم 4 مضادات حيوية منفصلة في وسط الاستزراع ، لذلك من غير المحتمل حدوث تلوث. ومع ذلك ، إذا كان استخدام المضادات الحيوية يمثل مشكلة ، فيمكن نقل إعداد التشريح هذا داخل غطاء معقم. للحفاظ على صلاحية الخلية ، يجب تبريد جميع محاليل التشريح مسبقا عند 4 درجات مئوية ، ويجب إكمال التشريح في أسرع وقت ممكن. نحن لا نقوم بإجراء التشريح على الجليد. طريقة تشريح الخلايا العصبية الجنينية للدماغ المتوسط للفأر مطابقة للطرق الموصوفة سابقا.

1. قم بإعداد مساحة على مقعد بالقرب من مجهر التشريح باستخدام وسادة ماصة ورشها بكمية وفيرة بنسبة 70٪ EtOH.
2. رش طبقين زجاجيين من بتري مقاس 100 × 15 مم وطبق بتري زجاجي مقاس 50 × 10 مم مع 70٪ EtOH واترك EtOH يتبخر. بمجرد التبخر ، ضع 50 مل من 1x HBSS المعقم في كل طبق بتري 100 × 15 مم.
3. اغمر المقص الجراحي والملقط وشفرة الميكروتوم في 70٪ EtOH لمدة 10 دقائق على الأقل للتعقيم. ضع الأدوات على الوسادة الماصة حتى تجف.
4. باستخدام ثاني أكسيد الكربون₂ متبوعا بخلع عنق الرحم ، قم بالقتل الرحيم لفئران الحمل الموقوتة البالغة من العمر 2-3 أشهر في اليوم الجنيني 14.
5. رش بطن الفئران التي تم قتلها رحيما بنسبة 70٪ EtOH. باستخدام الملقط ، أمسك أسفل البطن وافتح تجويف البطن باستخدام مقص جراحي. ابدئي في القطع بالقرب من المكان الذي تمسك فيه الملقط البطن ، وقم بعمل جروح جانبية على كل جانب حتى يمكن طي جدار البطن للخلف ويظهر الرحم بوضوح.
6. باستخدام المقص الجراحي ، قم بقص طرفي قرن الرحم. ثم قم بإزالة الرحم ووضعه في طبق بتري مع 1x HBSS.
7. باستخدام ملقط مستقيم الطرف، قم بإزالة الأجنة بعناية من الرحم. اترك الأجنة في HBSS طوال هذه العملية. باستخدام الملقط أو شفرة ميكروتوم، قم بقطع رأس الأجنة بسرعة عن طريق القطع بالقرب من الرقبة. جعل مستوى القطع قدر الإمكان.
8. تحت مجهر تشريح ، انقل رأس الجنين إلى طبق بتري جاف مقاس 50 مم وضعه على الجانب البطني. قم بتثبيت الرأس بالملقط عن طريق وضع العينين / الخطم واختراقهما. يجب أن تكون الملقط بزاوية لأسفل عند ~ 45 درجة لتجنب اختراق الدماغ المتوسط.
9. باستخدام الملقط من ناحية أخرى ، قم بإزالة الطبقة الشفافة من الجلد والجمجمة بعناية قبل التلال البارزة للدماغ المتوسط. ابدأ بالقرب من خط الوسط وقم بإزالة الجلد والجمجمة ذيلية حتى ينكشف الدماغ المتوسط بالكامل.
10. أمسك الملقط بشكل عمودي على الدماغ المتوسط المكشوف ، مع طرف واحد بين القشرة والدماغ المتوسط والآخر بالقرب من المخيخ. اضغط لأسفل واضغط على الملقط معا لإزالة الدماغ المتوسط بالكامل. يجب أن يكون سمك جزء الدماغ الأوسط حوالي 0.5 مم. ضع جزء الدماغ المتوسط في طبق بتري الثاني المليء ب 1x HBSS الطازج. كرر هذه العملية لكل جنين.
11. باستخدام مجهر التسليح ، ضع جزء الدماغ بحيث يكون الجانب البطني متجها لأعلى. إذا كانت السحايا لا تزال متصلة ، فقم بإزالتها بعناية عن طريق الإمساك بها بالملقط ورفعها لأعلى وبعيدا عن جزء الدماغ.
12. يجب أن يحتوي جزء الدماغ على 4 أرباع مرئية. ضع المقطع بطريقة يتم وضع الربعين الأصغر أعلى من الربعين الأكبر. هناك سلسلة من التلال البارزة تفصل بين الربعين العلويين (الصغيرين) والرباعين السفليين (الكبيرين).
13. باستخدام الملقط ، قم بقرص وفصل الأرباع العليا عن الأرباع السفلية ، ثم تخلص من الأرباع العليا. سيكون للأرباع السفلية المتبقية أنسجة زائدة بشكل جانبي على الجانب الظهري ، وسيبدو هذا النسيج أقل تعتيما من الأنسجة البطنية المتبقية. قم بإزالة الأنسجة الظهرية الأقل كثافة وتخلص منها. يجب أن يحتوي الجزء المتبقي على كل من المادة السوداء المضغوط (SNc) والمنطقة السقيفية البطنية (VTA).
14. باستخدام الملقط ، قم بتقطيع الجزء المتبقي من الأنسجة البطنية إلى 4 قطع أصغر وباستخدام ماصة تجويف بعرض 1 مل ، انقل هذه الأجزاء في أنبوب مخروطي 15 مل مع 1x HBSS. احتفظ بالأنبوب المخروطي مع أجزاء الدماغ على الجليد طوال العملية.
15. كرر هذه العملية لجميع أجزاء الدماغ المتبقية.

< p class = "jove_title" >4. تفكك الخلايا

1. الهضم الأنزيمي للخلايا
   1. استنشق HBSS بعناية من الأنبوب المخروطي سعة 15 مل الذي يحتوي على أجزاء من الدماغ المتوسط ، مع ترك الأجزاء الموجودة في الجزء السفلي من الأنبوب.
   2. أضف ~ 800 ميكرولتر من محلول غراء إلى الأنبوب وضعه في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. قم بتعليق الخلايا عن طريق النقر على الأنبوب واستبدلها بحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق إضافية.
   3. باستخدام طرف ماصة عريض التجويف سعة 1 مل، قم بإزالة أجزاء الدماغ الأوسط فقط إلى حصة 1 مل من DNase. اسمح للأجزاء بالوصول إلى الجزء السفلي من الكمية أو حوالي 1 دقيقة من التعرض.
   4. باستخدام طرف ماصة عريض التجويف سعة 1 مل، قم بإزالة أجزاء الدماغ الأوسط فقط إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 2 مل من محلول التوقف. اسمح للأجزاء بالاستقرار في الجزء السفلي من الأنبوب وكرر الشطف في أنبوب مخروطي إضافي مملوء بمحلول التوقف.
2. التخلي الميكانيكي لتعليق الخلية
   1. في المحطة الثانية، أنبوب شطف المحلول، باستخدام طرف ماصة عريض التجويف سعة 1 مل، قم بعمل ماصة الخلايا لأعلى ولأسفل 10 مرات حتى لا تكون هناك أجزاء كبيرة من الأنسجة مرئية. من المهم تجنب الإفراط في المعايرة للحد الأدنى من تحلل الخلايا.
   2. قم بإخراج 300 ميكرولتر من محلول BSA بنسبة 4٪ ببطء إلى قاع الأنبوب المخروطي سعة 15 مل الذي يحتوي على أجزاء دماغية. قم بإزالة طرف الماصة بعناية للحفاظ على طبقة التعليق. جهاز طرد مركزي عند 0.4 × جم لمدة 3 دقائق. بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الخلايا في 400 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا.

< p class = "jove_title" >5. طلاء الخلايا

ملاحظة: بناء على التجربة ، يتم جمع حوالي 100000 خلية قابلة للحياة لكل جنين. عادة ما يكون للفئران الحامل الموقوتة 2-3 أشهر أحجام قمامة من 8-10 أجنة ؛ لذلك ، فإن التقدير التقريبي لإجمالي الإنتاجية للخلايا لكل فأر حامل موقوت هو حوالي 1 مليون خلية.

1. باستخدام مقياس كثافة الدم ، قم بإجراء تعداد الخلايا ثم قم بتخفيف المعلق إلى 2,000 خلية / ميكرولتر باستخدام وسط زراعة الخلايا. ثلاثي لفترة وجيزة للخلط.
2. قم بإزالة الغطاء بمحلول اللامينين من الخطوة 2 من الحاضنة واستنشاق محلول اللامينين المتبقي من الغطاء المطلي باستخدام فراغ. قم بتركيب الألواح بسرعة لمنع الجفاف تماما. ماصة 100 ميكرولتر (2.0 × 10⁵ خلايا / غطاء غطاء) على كل غطاء وضع أطباق بتري في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
3. أضف 3 مل من وسط زراعة الخلايا بحذر إلى كل طبق وضعه مرة أخرى في الحاضنة 37 درجة مئوية. قم بإجراء تغييرات نصف متوسطة مرتين أسبوعيا لمدة أسبوعين.

< p class = "jove_title" >6. إصابة زراعة الخلايا في 14 DIV بالنواقل الفيروسية المرتبطة بالغدة (AAV)

1. لكل طبق ، قم بإعداد 1 مل من وسط DMEM الخالي من المصل مع 1 ميكرولتر من hSyn-GCaMP6f AAV (1.0 × 10¹³ عيرا)
2. استنشق وسط زراعة الخلايا من كل طبق واستبدله ب 1 مل من DMEM الخالي من المصل الذي يحتوي على hSyn-GCaMP6f. ثم ضع الأطباق مرة أخرى في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
3. استنشق الوسط الخالي من المصل الذي يحتوي على AAVs واستبدله ب 3 مل من وسط زراعة الخلايا. ضع الأطباق مرة أخرى في الحاضنة 37 درجة مئوية. لقد وجدنا أن 5-7 أيام من عدوى AAV تسمح بمستويات مثالية من تعبير GCaMP. طوال هذه الفترة من العدوى الفيروسية ، استمر في تغيير الوسط كل 2-3 أيام.

7. تصوير حي متحد البؤر Ca²⁺ بين 19-21 DIV

1. تحضير المخازن المؤقتة للتسجيل
1. لعمل 1 لتر من المخزن المؤقت لتسجيل HEPES ، أضف: 9.009 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.3728 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.901 جم من الجلوكوز D ، و 2.381 جم من HEPES ، و 2 مل من محلول مخزون 1 M CaCl₂ ، و 500 ميكرولتر من محلول مخزون 1 M MgClCl₂ إلى 800 مل من H 2 O. ارفع الرقمالهيدروجيني إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم. أحضر إلى الحجم النهائي 1 لتر.
2. لعمل 200 مل من المخزن المؤقت لتسجيل الغلوتامات 20 ميكرومولار ، قم بتخفيف 40 ميكرولتر من محلول مخزون الغلوتامات 100 ملي مولار إلى 200 مل من المخزن المؤقت لتسجيل HEPES الموصوف أعلاه.
3. لعمل 200 مل من المخزن المؤقت لتسجيل NBQX 10 ميكرومتر، قم بتخفيف 200 ميكرولتر من محلول مخزون NBQX سعة 10 ملي في 200 مل من المخزن المؤقت لتسجيل HEPES.
2. التصوير متحد البؤر
1. املأ طبق بتري معقم مقاس 35 مم ب 3 مل من المخزن المؤقت للتسجيل.
2. قم بإزالة طبق بتري مقاس 35 مم مع الثقافات المصابة من الحاضنة 37 درجة مئوية. باستخدام ملقط رفيع الأطراف، أمسك بعناية حافة غطاء واحد وانقله بسرعة إلى طبق بتري المملوء بمخزن مؤقت للتسجيل. ضع الغطاء المتبقي في الوسط مرة أخرى في الحاضنة 37 درجة مئوية. انقل الطبق باستخدام المخزن المؤقت للتسجيل إلى المجهر متحد البؤر.
3. ابدأ تشغيل برنامج التصوير. انتقل إلى الخطوة التالية أثناء تهيئتها.
4. ابدأ تشغيل المضخة التمعجية وضع الخط في المخزن المؤقت للتسجيل. معايرة سرعة التدفق لتكون 2 مل / دقيقة.
5. انقل قسيمة الغطاء المصابة من طبق بتري مقاس 35 مم إلى حمام التسجيل.
6. باستخدام هدف الغمر في الماء 10x وضوء BF ، ابحث عن مستوى التركيز وابحث عن منطقة ذات كثافة عالية من أجسام الخلايا العصبية. قم بالتبديل إلى هدف الغمر في الماء بمقدار 40x وباستخدام ضوء BF ، أعد تركيز العينة.
7. في نافذة "قائمة الأصباغ" داخل FluoView ، حدد AlexaFluor 488 وقم بتطبيقه.
8. يمكن أن يكون تعبير AAV متغيرا ؛ لذلك ، من أجل منع التعرض المفرط والتبييض الضوئي للفلوروفورات ، ابدأ بإعدادات منخفضة HV وطاقة الليزر. بالنسبة لقناة AlexaFluor 488 ، اضبط الجهد العالي (HV) على 500 ، والكسب على 1x ، والإزاحة على 0. بالنسبة لخط الليزر 488 ، اضبط الطاقة على 5٪. من أجل زيادة الحجم الفعال المصور في المستوى z ، قم بزيادة حجم الثقب إلى 300 ميكرومتر. استخدم خيار المسح الضوئي "التركيز × 2" لضبط إشارات الانبعاث على النحو الأمثل إلى مستويات التشبع الفرعي. من هنا ، يمكن ضبط الإعدادات حتى يتم تحقيق الرؤية المثالية لكل قناة.
ملاحظه: لالتقاط النطاق الكامل لتدفقات Ca²⁺ بدقة باستخدام GCaMP ، اضبط إعدادات طاقة الجهد العالي والليزر الأساسية للسماح بزيادة شدة الفلورسنت دون تشبع الكاشف.
9. بمجرد تحسين إعدادات المجهر ، حرك المسرح لتحديد موقع منطقة بها خلايا متعددة تعرض تغييرات تلقائية في مضان GCaMP6f والتركيز على المستوى المطلوب للتصوير.
10. استخدم أداة "Clip rect" لقص إطار التصوير إلى حجم يمكن أن يحقق فاصل إطار أقل بقليل من 1 ثانية. يعد ذلك ضروريا لضبط الفاصل الزمني للتصوير عند 1 إطار في الثانية.
11. اضبط نافذة "الفاصل الزمني" على قيمة 1.0 ونافذة "Num" إلى 600.
ملاحظه: من أجل توفير مخازن تسجيل مختلفة في النقطة الزمنية المطلوبة (300 ثانية) ، من المهم معايرة زمن انتقال المضخة لتوصيل الحل الجديد إلى الحمام. سيعتمد هذا على معدل نضح المحلول (2 مل / دقيقة) وطول الخط المستخدم لضخ المحلول.
12. لالتقاط فيلم من السلسلة t ، حدد خيار "الوقت" ثم استخدم خيار المسح الضوئي "XYt" لبدء التصوير.
13. شاهد شريط تقدم التصوير وحرك الخط من المخزن المؤقت لتسجيل HEPES إلى المخزن المؤقت لتسجيل الغلوتامات 20 ميكرومتر في النقطة الزمنية المناسبة (على سبيل المثال، إذا تمت معايرة زمن انتقال المضخة لتوصيل المحلول عند 60 ثانية، فقم بتحريك الخط إلى مخزن الغلوتامات المؤقت عند 240 إطارا من أجل توصيل الغلوتامات عند 300 ثانية).
14. عند اكتمال التصوير، حدد الزر Series Done واحفظ فيلم السلسلة t النهائي. استمر في تقويض 20 ميكرومتر من الغلوتامات لمدة 5 دقائق إضافية ، بحيث تعرضت الخلايا العصبية المستنبتة للغلوتامات لمدة 10 دقائق. كرر هذه العملية لكل قسيمة غلاف ليتم تصويرها.
15. بعد التعرض الإضافي لمدة 5 دقائق ل 20 ميكرومتر من الغلوتامات ، قم بإزالة الغطاء من الحمام وضعه مرة أخرى في طبق بتري مقاس 35 مم الذي يحتوي على مخزن مؤقت للتسجيل حتى اكتمال يوم التصوير.

المواد