عزل الخلايا العصبية الحسية والزراعة المشتركة مع الخلايا القاتلة الطبيعية

الملخص

المصدر: Ahmadi، A.، et al. إثارة التفاعل بين الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا العصبية المستقبلة للألم. J. Vis. Exp. (2022).

يصف هذا الفيديو عزل الخلايا العصبية DRG من خلال الهضم الأنزيمي ، والتفكك الميكانيكي ، والطرد المركزي المتدرج. يتم زراعة خلايا DRG بشكل مشترك مع الخلايا القاتلة الطبيعية على مصفوفة خارج الخلية لدراسة التفاعل بين الخلايا المناعية والخلايا العصبية الحسية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. عزل الخلايا القاتلة الطبيعية وثقافتها وتحفيزها

1. توليد الخلايا العصبية المستقبلة للألم سليمة (التحكم في littermate; TRPV1wt: :D TAfl / wt) والفئران المستعصصة (TRPV1cre: :D TAfl / wt) عن طريق عبور الفئران السمية lox-stop-lox-diphtheria (DTAfl / fl) مع الفئران TRPV1cre / wt.
2. باستخدام ثاني أكسيد الكربون2 استنشاق ، قم بالقتل الرحيم لفأر التحكم الساذج في القمامة (TRPV1wt: :D TAfl / wt).
3. اجمع الطحال في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
4. تجانس الطحال باستخدام مدقة.
5. تمييع الخلايا ب 1 مل من PBS المعقم.
6. قم بتصفية الخليط من خلال مصفاة خلوية 50 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
7. قم بتعبئة الحجم (10 مل) باستخدام PBS معقم.
8. اجمع 10 ميكرولتر وعد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
9. الطرد المركزي للخلايا (500 × جم ، 5 دقائق) وإزالة المادة الطافية.
10. أعد تعليق الخلايا بتركيز 10⁸ خلايا / مل في وسط RPMI 1640 مكمل.
11. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لتنقية خلايا الطحال الطبيعية القاتلة مغناطيسيا (NK) باستخدام مجموعة عزل الخلايا الطبيعية للفأر. تأكد من نقاء الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام قياس التدفق الخلوي.
12. اجمع 10 ميكرولتر وعد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
13. الطرد المركزي للخلايا (500 × جم ، 5 دقائق) وإزالة المادة الطافية.
14. أعد تعليق الخلايا القاتلة الطبيعية في وسط استزراع RPMI 1640 مكمل (يحتوي على IL-2 و IL-15).
15. استزراع 2 × 10⁶ خلايا NK / مل في صفيحة قاع 96 بئرا لمدة 48 ساعة.

< p class = "jove_title" >2. عزل وثقافة الخلايا العصبية DRG

1. في 24 ساعة قبل نهاية تحفيز الخلايا القاتلة الطبيعية (الخطوة 1.15) ، قم بتغطية صفيحة 96 بئرا ب 100 ميكرولتر / بئر من اللامينين (1 نانوغرام / مل) واحتضانها لمدة 45 دقيقة (37 درجة مئوية).
2. بعد الحضانة ، قم بإزالة المحلول واترك الآبار تجف في الهواء في خزانة السلامة الحيوية.
3. باستخدام ثاني أكسيد الكربون2 استنشاق ، القتل الرحيم للخلايا العصبية المستقبلة للألم سليمة (التحكم في littermate; TRPV1wt: :D TAfl / wt) أو مفصل (TRPV1cre: :D TAfl / wt) الفئران.
   ملاحظة: يفضل استنشاق ثاني أكسيد الكربون على خلع عنق الرحم لأنه يتجنب تعطيل الأعصاب الشوكية المتصلة ب DRG (عقدة الجذر الظهري).
4. قم بتأمين الماوس على السبورة في وضع الانبطاح ، وارفع الجلد ، وشق الجلد على طول العمود الظهري.
5. قطع المفصل القطني العجزي وفصل العجز عن العمود الفقري القطني بالمقص.
6. افصل العمود الفقري عن طريق قطع العضلات والأضلاع على جانبي العمود الفقري في اتجاه الجمجمة حتى يتم الوصول إلى قاعدة الجمجمة.
7. باستخدام المقص ، قم بقطع العمود الفقري في المفصل القذالي.
8. إزالة العضلات والأنسجة الدهنية من العمود الفقري.
9. قم بتثبيت العمود الفقري وافتحه لإزالة الحبل الشوكي والوصول إلى DRG. ابحث عن DRG في الثقبة الفقرية المتصلة بالحبل الشوكي من خلال الجذر الظهري ولكن منفصلة عن السحايا.
10. احصد DRGs في أنبوب مخروطي سعة 15 مل مملوء ب 10 مل من DMEM المكمل بالثلج.
11. الطرد المركزي المستحضر (200 × جم ، 5 دقائق ، درجة حرارة الغرفة) وإزالة المادة الطافية.
12. أضف 250 ميكرولتر من PBS المحتوي على الكولاجيناز IV (1 مجم / مل) و Dispase II (2.4 وحدة / مل).
13. احتضان DRG بمحلول Collagenase IV / Dispase II (C / D) (80 دقيقة ، 37 درجة مئوية ، تحريض خفيف). عند تجميع العقد من عدة فئران ، حافظ على نسبة 125 ميكرولتر من محلول C / D لكل عقدة.
14. لتعطيل الإنزيمات ، أضف 5 مل من وسط DMEM المكمل (Dulbecco's Modified Eagle Medium).
15. قم بالطرد المركزي للمحلول (200 × جم ، 5 دقائق) وقم بإزالة المادة الطافية برفق باستخدام ماصة.
16. لتجنب فقدان الخلايا غير المرغوب فيه ، اترك ~ 100 ميكرولتر من المادة الطافية.
17. أضف 1 مل من وسط DMEM المكمل.
18. باستخدام مسدس ماصة وثلاث ماصات زجاجية من مادة باستور ذات الأحجام المتناقصة، قم بترتيتر DRG برفق (~ 10 لأعلى/لأسفل لكل حجم ماصة باستور) في مستحضر أحادي الخلية.
19. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتخفيف ألبومين مصل الأبقار (BSA) في PBS المعقم (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) إلى تركيز نهائي بنسبة 15٪. قم بتخزين 1 مل من الكميات عند -20 درجة مئوية.
20. قم بإنشاء تدرج BSA في أنبوب مخروطي سعة 15 مل عن طريق إضافة 2 مل من PBS المعقم وتوزيع 1 مل ببطء من محلول BSA بنسبة 15٪ في الجزء السفلي من الأنبوب. تجنب تعطيل التدرج عن طريق إزالة الماصة برفق.
21. باستخدام ماصة P200، قم ببسط تعليق العقد الثلاثي (الذي يحتوي على الخلايا العصبية) ببطء على جانب الأنبوب في التدرج.
22. جهاز الطرد المركزي تدرج BSA المحتوي على الخلايا العصبية (200 × جم ، 12 دقيقة ، درجة حرارة الغرفة). اضبط تسارع وتباطؤ جهاز الطرد المركزي على الحد الأدنى للسرعة.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، ستكون الخلايا العصبية في قاع الأنبوب ، بينما سيتم احتجاز حطام الخلية في تدرج BSA.
23. قم بإزالة كل المادة الطافية برفق باستخدام ماصة.
24. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من Neurobasal.
25. اللوحة 10⁴ خلايا عصبية لكل بئر (200 ميكرولتر من العصبي القاعدي / البئر) في لوحة مسطحة القاع 96 بئر مطلية ><بطبقة من اللامينين. ملاحظة: في المتوسط ، سيتمكن المحقق من ملء ~ 8 آبار لكل فأر.
26. استزراع الخلايا العصبية (37 درجة مئوية ، بين عشية وضحاها) للسماح بالارتباط.

< p class = "jove_title" >3. الثقافة المشتركة

1. قم بإزالة القاعدة العصبية ببطء من ثقافة الخلايا العصبية.
2. بعد 48 ساعة من التحفيز باستخدام IL-2 و IL-15 (انظر الخطوات 1.14-1.15) ، قم بتعليق الخلايا القاتلة الطبيعية وأضف 10⁵ خلايا NK / بئر إلى ثقافة الخلايا العصبية (96 بئر صفيحة سفلية مسطحة).
   ملاحظة: في المتوسط ، سيتمكن المحقق من ملء ~ 6 آبار لكل فأر.
3. الزراعة المشتركة للخلايا في MX العصبي القاعدي المكمل (37 درجة مئوية ، 48 ساعة).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ب -27 مختبر جاكسون رقم القط: 009669 ألبومين مصل البقر (BSA) درجة ثقافة أدوات الدقة العالمية رقم القط: 504167 BV421 مضاد للفأر NK-1.1 فيشر ساينتيك رقم القط: 12430112 مصفاة الخلية (50 ميكرومتر) فيشر ساينتيك رقم القط: A3160702 كولاجيناز الرابع فيشر ساينتيك رقم القط: 15140148 Dispase II فيشر ساينتيك رقم القط: 13-678-20B وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) فيشر ساينتيك رقم القط: 07-200-95 طقم عزل الخلايا EasySep Mouse NK سيغما رقم القط: CLS2595 حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) سيغما رقم القط: C0130 مصل الأبقار الجنينية (FBS) سيغما رقم القط: 806552 ماصة زجاجية باستور سيغما رقم القط: 470236-274 عامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF) VWR رقم القط: 02-0131 لامينين سيدارلين رقم القط: 03-50 / 31 ل-جلوتامين جيبكو رقم القط: A14867-01 مؤتلف الفأر IL-15 جيبكو رقم القط: 22400-089 المؤتلف للفأر IL-2 جيبكو رقم القط: 21103-049 عامل نمو الأعصاب (NGF) تقنيات الحياة رقم القط: 13257-019 الوسائط العصبية القاعدية بيبروتك رقم القط: 450-51-10 البنسلين والستربتومايسين بيبروتك رقم القط: 210-15 المدقة تقنية الخلايا الجذعية رقم القط: 19855 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بيوليجند رقم القط: 108732 استنساخ PK136 وسائط RPMI 1640 بيوليجند رقم القط: 137606 استنساخ 29A1.4 ملاقط وأدوات تشريح. بيوليجند رقم القط: 65-0865-14 صفيحة 96 بئر على شكل حرف U بيوليجند رقم القط: 101319 صبغ البقاء eFlour-780 بيكتون ديكنسون حاضنة CO2 مجهر تشريح