عزل وثقافة الخلايا العصبية الدوبامين في منتصف الدماغ الجنيني الأولي

الملخص

المصدر: Er, S., et al. دراسة تراكم α-synnuclein المستحث مسبقا في الخلايا العصبية الدوبامين في منتصف الدماغ الجنيني الأولي للفأر. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح الفيديو عملية عزل وزراعة الخلايا العصبية الدوبامين من الدماغ المتوسط لأجنة الفئران. يتم فصل أرضيات الدماغ المتوسط البطني المعزولة باستخدام الإنزيمات. يتم حصاد الخلايا العصبية الدوبامين الناتجة ونقلها إلى جزر صغيرة داخل لوحات متعددة الآبار. يتم تحضين الخلايا بوسط خلية عصبية الدوبامين للحفاظ على الخلايا بكثافة عالية داخل الجزر الصغيرة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. التحضير

1. تحضير وسط الخلايا العصبية الدوبامين (DPM) مع 0.46٪ D-glucose ، 1٪ L-glutamine ، 1٪ N2 ، 0.2٪ بريموسين ، مكتمل بمزيج Eagle المتوسط / المغذيات المعدل من Dulbecco F-12 (DMEM / F12). قم بتصفية DPM بعد خلط المكونات. قم بتخزين DPM عند 4 درجات مئوية وقم بتسخين كل كمية مرة واحدة فقط.
   ملاحظه: يجب ألا يحتوي DPM على عامل النمو المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF) ، لأنه سيقلل من تراكم α-synuclein في الخلايا العصبية الدوبامين.
2. قم بإعداد ماصات زجاجية مصنوعة من السيليكون شديدة الكارهة للماء، وبالتالي تقليل الالتصاق بالسطح وفقدان الخلايا أثناء المعالجة الأولية للخلايا العصبية الجنينية.
   1. أضف 10 مل من سائل السيليكون إلى 1 لتر من الماء المقطر واخلطه عن طريق التقليب في وعاء سعة 2 لتر. اترك الماصات الزجاجية مغمورة في محلول السيليكون لمدة 15 دقيقة.
   2. اشطف الماصات 3-5 مرات بالماء المقطر. جفف الماصات طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (RT) أو لمدة 1-2 ساعة عند 100-120 درجة مئوية وقم بتسخين مساحة معقمة لتسريع عملية التجفيف.
   3. قم بتعقيم الماصات عن طريق التعقيم القياسي في كيس الأوتوكلاف محكم الغلق.
3. قم بإعداد 96 لوحة بئر مطلية ب 96 بئر مع قيعان شفافة عن طريق إضافة 60 ميكرولتر من محلول PO في الآبار الوسطى للوحة البئر 96 لاستخدامها في بذر الخلايا العصبية ، مع ترك صف / عمود واحد على الأقل من الآبار عند حواف اللوحة لتجنب تأثيرات الحافة. احتفظ باللوحة المطلية طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو 4 ساعات عند RT.
4. قبل طلاء الخلايا ، قم بشفط الفم تماما واغسل الخلايا ثلاث مرات ب 100 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS). قم بشفط 1x PBS من الآبار واحتفظ بغطاء اللوحة مفتوحا للتجفيف الكامل.
   ملاحظه: من الممكن جمع أمر الشراء المستخدم وتصفيته لإعادة استخدامه. يمكن تكرار ذلك مرتين لنفس محلول أمر الشراء.
5. أضف 50 ميكرولتر من DPM إلى الآبار المطلية مسبقا. قم بشفط DPM من الآبار بطرف بلاستيكي 100 ميكرولتر وخدش قاع البئر في نفس الوقت بحركات دائرية لإزالة الطلاء في محيط كل بئر. ستبقى جزيرة مطلية ب PO في منتصف البئر.
6. تحت غطاء رقائقي ، أضف 10 ميكرولتر من DPM إلى منتصف كل جزيرة مطلية لإنشاء جزر صغيرة.
   ملاحظه: يمكن الاحتفاظ بلوحة ذات جزر صغيرة مغطاة ب DPM تحت غطاء التدفق الصفحي لمدة 1-2 ساعة أثناء عزل الخلايا

فئة

2. عزل أرضية الدماغ المتوسط البطني عن أجنة الفئران في اليوم الجنيني 13.5 (E13.5

)

1. قبل التشريح ، املأ طبق بتري مقاس 10 سم بمخزن Dulbecco واحتفظ به على الجليد.
2. قتل أنثى فأرة حامل E13.5 وفقا لإرشادات المؤسسة. ضع الماوس بشكل مسطح على ظهره ورش الجسم الأمامي بنسبة 70٪ من الإيثانول. رفع الجلد فوق الرحم بالملقط وعمل شق بمقص جراحي لكشف الرحم.
3. قم بإزالة الرحم بعناية وضعه في طبق بتري المعد مسبقا على الثلج.
4. باستخدام مقص جراحي تحت غطاء المحرك الصفحي في RT ، قم بإزالة الأجنة بعناية من الرحم. قم بإزالة جميع بقايا المشيمة من الأجنة بالملقط وضعها في طبق بتري جديد مقاس 10 سم مملوء بمخزن Dulbecco.
5. باستخدام ملقط أو إبر التشريح ، قم بقطع الجزء الخلفي من الرأس من الأماكن المميزة بأسهم سوداء في الشكل 1 أ. خذ القطعة المقطوعة بعيدا عن باقي الجنين (الشكل 1 ب).
6. ضع الجزء الخلفي من القطعة المقطوعة باتجاه المراقب (الشكل 1 ج) واقطعه برفق من الذيلية إلى الجمجمة (الشكل 1 د). من 0.5 مم تحت فتحة الجمجمة ، قم بقطع منطقة 2 مم^2-3 مم² ، كما هو موضح في الشكل 1E.
7. اجمع أرضية الدماغ المتوسط البطني (انظر الشكل 1F) في أنبوب فارغ للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل. احتفظ بأنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد حتى يتم جمع جميع أرضيات منتصف الدماغ فيه.
   ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن جمع أرضيات الدماغ المتوسط باستخدام ماصة دقيقة سعة 1 مل بعد تشريح جميع أدمغة الأجنة.

< p class = "jove_title" >3. إنشاء مزارع الدماغ المتوسط الجنينية الأولية من أجنة الفئران E13.5 في شكل 96 لوحة بئر

1. بعد جمع أرضيات الدماغ المتوسط من جميع الأجنة في نفس الأنبوب سعة 1.5 مل ، قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي ل Dulbecco واغسل قطع الأنسجة ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من Ca2 ⁺ ، Mg2 ⁺ خال من محلول هانك المتوازن (HBSS).
2. قم بإزالة HBSS وأضف 500 ميكرولتر من 0.5٪ تريبسين إلى الأنبوب. احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. أثناء الحضانة ، قم بتسخين 1.5 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) عند 37 درجة مئوية ، أضف 30 ميكرولتر من DNase I إلى FBS ، واخلطها. أيضا ، قم بتلميع طرف ماصة زجاجية من السيليكون. تأكد من أن الفتحة لا تحتوي على حواف حادة وبنفس حجم طرف الماصة الدقيقة سعة 1 مل.
   ملاحظه: كبديل ، يمكن استخدام طرف ماصة دقيقة منخفض الالتصاق 1 مل للتصاق. ومع ذلك ، يبدو أن الماصات الزجاجية المصنوعة من السيليكون تعطي أفضل النتائج.
4. بمجرد انتهاء الحضانة في الخطوة 3.2 ، أضف 500 ميكرولتر من مزيج FBS / DNase إلى الأنسجة المهضومة جزئيا. استخدم الماصة الزجاجية لترتيب الأنسجة في مزيج FBS / التربسين. ثلاثي الأبعاد حتى تنفصل الأنسجة إلى جزيئات صغيرة بالكاد مرئية. تجنب الفقاعات أثناء التجربة.
5. دع الجسيمات المتبقية تترسب في قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق عن طريق الجاذبية. دون سحب الراسب في الأسفل ، اجمع المادة الطافية في أنبوب بولي بروبيلين مخروطي فارغ سعة 15 مل.
6. قم بتخفيف FBS/DNase I من الخطوة 3.3 (98:2) باستخدام 1,000 ميكرولتر من HBSS للحصول على FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). امزج عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. أضف 1,000 ميكرولتر من المزيج الجديد إلى الجسيمات المتبقية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. ثلاثي الأبعاد مرة أخرى وكرر الخطوة 3.5.
7. كرر الخطوة السابقة مرة أخرى لاستخدام جميع FBS / DNase-I / HBSS (49:1:50).
8. بمجرد جمع كل المادة الطافية داخل الأنبوب سعة 15 مل (من الخطوات 3.5 و 3.7 و 3.8) ، استخدم جهاز طرد مركزي منضدي لتدوير المادة الطافية (~ 3 مل) عند 100 × جم ، لمدة 5 دقائق.
9. اغسل حبيبات الخلية بإضافة 2 مل من DPM إلى الأنبوب وقم بتدويرها عند 100 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وكرر الغسيل 2x لتقليل الحطام في الخلايا المحببة.
   ملاحظه: دائما استخدام جديد, DPM دافئ للخلايا العصبية المستنبتة. بالنسبة لخطوات الغسيل ، لا يجب أن يكون DPM طازجا ، ولكن يجب تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
10. تمييع الخلايا ب DPM طازج ودافئ ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. تعتمد كمية DPM للتخفيف على عدد الأجنة المستخدمة في تشريح الأنسجة. على سبيل المثال ، استخدم 150 ميكرولتر من DPM لتخفيف الخلايا التي تم الحصول عليها من عشرة أجنة.
11. نقل 10 ميكرولتر من الخلايا في DPM إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. امزجها مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ بقعة تريبان زرقاء. عد الخلايا الحية (أي Trypan blue سالبة) باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي.
    ملاحظه: استخدم 30,000 خلية للطلاء لكل بئر للحصول على ~ 1,000 خلية عصبية من الدوبامين لكل بئر. إذا كانت كثافة الخلية أعلى من ~ 30,000 خلية لكل 6 ميكرولتر ، فقم بتخفيف الخلايا باستخدام DPM قبل الطلاء بحيث لا يقل حجم البذر عن 6 ميكرولتر.
12. دون لمس قاع الآبار ، قم بإزالة DPM من الجزر الصغيرة التي تم إنشاؤها في الخطوة 1.6.
13. من أجل الحصول على كثافة خلية قابلة للتكرار في كل بئر ، قم بخلط الخلايا عن طريق سحب العينة اللطيف قبل الطلاء في البئر. باستخدام ماصة دقيقة من 1 إلى 10 ميكرولتر ، أضف 6 ميكرولتر من الخلايا إلى منتصف البئر ، في موقع كل جزيرة صغيرة سابقة.
14. املأ الآبار الفارغة عند حواف اللوحة ب 150 ميكرولتر من الماء أو 1x PBS لتقليل التبخر من الآبار التي تحتوي على مزارع عصبية. احتضان اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 1 ساعة.
15. بعد 1 ساعة ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة ، وأضف 100 ميكرولتر من DPM في كل بئر مع الخلايا وضعها مرة أخرى في الحاضنة.
16. بعد يومين من الطلاء (اليوم في المختبر 2 ، أو DIV2) ، قم بإزالة 25 ميكرولتر وأضف 75 ميكرولتر من DPM الطازج لرفع حجم الوسائط النهائي إلى 150 ميكرولتر وتجنب التبخر قدر الإمكان.
17. استبدل نصف الوسط ب DPM طازج (أي إزالة 75 ميكرولتر وإضافة 75 ميكرولتر DPM طازج) في DIV5. لا تقم بإجراء أي تغييرات على الوسائط بعد DIV5.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تشريح أرضية الدماغ المتوسط من جنين الفأر E13.5. (أ) يتم تمييز مواقع القطع في الجزء الخلفي من الرأس بأسهم سوداء وخطوط بيضاء متقطعة. (ب) تمت إزالة القطعة من باقي الجنين. القطعة التي تمت إزالتها محاطة بدائرة. (ج) تم تدوير القطعة بزاوية 90 درجة لمواجهة الخلف باتجاه المراقب. (د) تم فتح القطعة من الأسهم السوداء ، من الذ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.4٪ صبغة تريبان بلو جيبكو ، ثيرمو ساينتيفيك ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 15250061 15 مل أنبوب بولي بروبلين CELLSTAR Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, ألمانيا 188261 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية 10236276001 5 م حمض الهيدروكلوريك غير متاح غير متاح المطبخ الإعلامي، معهد التكنولوجيا الحيوية، جامعة هلسنكي 5 م هيدروكسيد الصوديوميد غير متاح غير متاح المطبخ الإعلامي، معهد التكنولوجيا الحيوية، جامعة هلسنكي لوحة عرض 96 بئر (أسود) بيركين إلمر ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 6005182 99.5٪ إيثانول (EtOH) Altia Oyj, Rajamäki, فنلندا غير متاح سائل السيليكون AquaSil ثيرمو ساينتفيك، والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية TS-42799 أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل معقم غير متاح غير متاح المطبخ الإعلامي، معهد التكنولوجيا الحيوية، جامعة هلسنكي جهاز صوتنة Bioruptor دياجينود ، لييج ، بلجيكا B01020001 محلول الملح المتوازن من Ca2 ⁺ ، Mg2 ⁺ خال من Hank (HBSS) جيبكو ، ثيرمو ساينتيفيك ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية هاتف: 14175-053 حزم برامج CellProfiler و CellAnalyst غير متاح غير متاح برنامج مجاني مفتوح المصدر جهاز طرد مركزي 5702 Eppendorf AG ، هامبورغ ، ألمانيا 5702000019 حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ هيرا سيل ، ثيرمو ساينتيفيك ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية غير متاح غرفة العد شركة BioRad ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 1450015 DeltaVision مجهر فائق الدقة مع طاولة هوائية وخزانة جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة ، بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 29254706 ديوكسيربونوكلياز I (Dnase I) روش ، بازل ، سويسرا 22098700 DMEM / F12 جيبكو ، ثيرمو ساينتيفيك ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 21331–020 عازلة Dulbecco غير متاح غير متاح المطبخ الإعلامي، معهد التكنولوجيا الحيوية، جامعة هلسنكي مصل الأبقار الجنينية (FBS) جيبكو ، ثيرمو ساينتيفيك ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 10500056 د-الجلوكوز سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية جي 8769 محلول ملحي عازلة الفوسبوهيات (PBS) غير متاح غير متاح المطبخ الإعلامي، معهد التكنولوجيا الحيوية، جامعة هلسنكي بريموسين إنفيفوجين، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية النمل-PM-1 ، النمل-PM-2 بولي إل أورنيثين سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية ص 4957 تريتون X-100 سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية 11332481001 تربسين MP Biomedicals ، شركة Valiant Co. ، يانتاي ، شاندونغ ، الصين هاتف: 2199700