تشريح وتركيب استخلاصات دماغ يرقات ذبابة الفاكهة

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تشريح أدمغة اليرقات في المحلول الملحي الخارجي الفسيولوجي (120 ملي كلوريد الصوديوم ، 4 ملي مولار MgCl₂ ، 3 ملي مولار KCl ، 10 ملي NaHCO₃ ، 10 ملي مولار جلوكوز ، 10 ملي مولار سكروز ، 5 ملي مولار N- [تريس (هيدروكسي ميثيل) ميثيل] -2-حمض أمينوإيثان سلفونيك (TES) ، 10 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES) ، 2 ملي مولار Ca²⁺ ، درجة الحموضة 7.2) تحت مجهر تشريح (قوة تكبير 4.5x) مع زوجين من ملقط تشريح الطرف القياسي # 5 (11 سم). استخدم زوجا واحدا من الملقط لتثبيت جسم اليرقات في مكانه والآخر لتشريح الدماغ بعناية. الحفاظ على أقراص العين وفصوص الدماغ والحبل العصبي البطني. قم بإزالة العضلات المتلتصقة لتقليل حركات العينة أثناء التصوير.
2. قم بإعداد شريحة زجاجية (25 × 75 × 1.0 مم³) واستخدم حقنة لرسم غرفة مربعة بشحم مفرغ.
3. أضف 20 ميكرولتر من المحلول الملحي الخارجي إلى الغرفة المربعة ذات حواجز الشحوم.
4. انقل أدمغة اليرقات المقطعة إلى الغرفة الموجودة على الشريحة الزجاجية باستخدام الملقط. اضبط موضع الأدمغة تحت نطاق التشريح للتأكد من أن الجانب الظهري متجها لأعلى.
5. قم بتغطية الحجرة بزلة غطاء زجاجي (22 × 22 × 0.15 مم³). يتم الآن تثبيت دماغ اليرقات على الشريحة داخل غرفة مملوءة بالمحلول الملحي الخارجي (الشكل 1 ب).
   ملاحظه: الضغط برفق على الغطاء يحصر الأدمغة ويقلل من انجراف العينة في جلسة التصوير اللاحقة.

الشكل 1: سير عمل بروتوكول تصوير ديناميكيات التغصنات وتقديرها الكمي. (أ) يحتوي البروتوكول على ست خطوات تغطي إعداد العينات وجمع الصور ومعالجة الصور والقياس الكمي شبه الآلي لديناميات التغصنات. (ب) رسم تخطيطي يوضح غرفة تصوير تحتوي على نبتة دماغ يرقات مركب مع الجانب الظهري لأعلى. يحتوي نبات الدماغ على خلية عصبية جانبية بطنية (LNv) مسماة بشكل فردي في كل فص ويتم غمرها في المحلول الملحي الخارجي. تدعم حواجز الشحوم المفرغة وزن الغطاء وتشكل غرفة صغيرة تمنع الدماغ من الحركة.