تمايز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى خلايا سلفية عصبية

الملخص

المصدر: Phillips ، A. W. ، et al. تطوير أجسام جنينية خالية من المصل مشتقة من HiPSC لاستجواب مزارع الخلايا الجذعية ثلاثية الأبعاد باستخدام فحوصات ذات صلة من الناحية الفسيولوجية. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح الفيديو تقنية لتفريق الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) إلى خلايا سلفية عصبية (NPCs). في البداية ، يتم زراعة hiPSCs على طبقة مغذية من الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs). بعد ذلك ، يتم فصل الخلايا ونقلها إلى صفيحة مطلية بالبوليمر الحيوي للسماح ل MEFs بالالتصاق ب hiPSCs والانفصال عنها. ثم يتم نقل hiPSCs المعلقة إلى لوحة قاع V ويتم طردها مركزيا لتشكيل مجاميع. أخيرا ، تؤدي إضافة وسيط تمايز إلى تمايز hiPSCs داخل المجموع إلى الشخصيات غير القابلة للعب.

البروتوكول

1. توليد الخلايا السلفية العصبية

1. الحفاظ على hiPSCs المشتقة من الخلايا الليفية وخلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) في صفائح 6 آبار على طبقة خلية مغذية جنينية للفأر المشعة γ (MEF) في وسط iPSC البشري المكملة بجزيئات صغيرة.
   ملاحظة: الصيانة اليومية هي نسخة معدلة من الإجراءات التي تم الإبلاغ عنها سابقا.
   1. لوحة 6 × 10⁵ MEFs على كل بئر من لوحة درجة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار في 300 ميكرولتر / وسط موصى به جيدا (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة).
   2. بعد 48 ساعة ، استبدل وسط MEFs بوسط 300 ميكرولتر / بئر hiPSC لمدة 1 ساعة قبل إضافة hiPSCs.
   3. قم بإذابة hiPSCs بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية وأضف ببطء 1 مل hiPSC متوسط بالتنقيط. انقل hiPSCs والمتوسط إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أضف وسيطا ليصل الحجم الإجمالي إلى 5 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 4 دقائق عند 129 × جم ، قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات برفق في وسط hiPSC سعة 1 مل مع مثبط بروتين كيناز مرتبط ب Rho (ROCK) بتركيز 1: 1,000.
   4. ضع تعليق الخلية (عادة ما يتم زرعه في 300,000 خلية / بئر) على طبقة خلية MEF واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، 95٪ رطوبة.
   5. مراقبة ثقافة iPSC عن كثب باستخدام مجهر ضوئي. بعد 48 ساعة ، قم بإزالة الثقافات ذات الحواف غير المستوية ، والتي نمت لتصبح شبيهة بالكيس أو تظهر بنية مصفرة تحت المجهر الضوئي لتقليل التمايز التلقائي.
      ملاحظه: بعد 7-10 أيام ، يجب أن تتشكل مستعمرات hiPSC. يجب أن تكون المستعمرات مستديرة ، مع حدود محددة بوضوح وكثافة خلايا موحدة ، وخالية من الخلايا غير المنتظمة المعبأة بشكل فضفاض.
   6. حدد يدويا مستعمرات hiPSC المستديرة لمسح ثقافة الخلايا المتمايزة تلقائيا. قم بتوسيع المستعمرات عن طريق وضعها على طبقات MEF جديدة. قم بتوسيع 1: 3 كل 7 أيام عندما تقترب الثقافات من التقاء وتتجمد.
2. بعد توسيع الخلايا وتجميدها (للنسخ الاحتياطي) ، قم بزراعة مستعمرات hiPSC على الألواح حتى تصل إلى التقاء 50-75٪.
بعد
3. سبعة أيام من الطلاء ، استخدم المعالجة الأنزيمية الخفيفة (5-10 دقائق مع 300 ميكرولتر من محلول الإنزيم) والخلية اللطيفة (2-4 مرات مع ماصة 1,000 ميكرولتر) لحصاد وإعداد hiPSCs لتمايز الخلايا السليفة العصبية.
4. الطرد المركزي تعليق الخلية عند 129 × جم لمدة 4 دقائق, شفط المادة الطافية, وإعادة تعليق الحبيبات في 5 مل iPSC الوسط البشري. انقل معلق الخلية إلى طبق ثقافة خلية مطلي بالجيلاتين بنسبة 5 سم بنسبة 0.1٪ لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية للتخلص من MEFs ولزيادة إنتاجية hiPSC. انقل الوسط (مع الخلايا غير الملتصقة) إلى طبق آخر مغطى بالجيلاتين مقاس 5 سم.
5. انقل الخلايا غير الملتصقة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل باستخدام ماصة نقل. اشطف الألواح برفق بمتوسط 3 مل وأضفها إلى أنبوب 15 مل.
قم
6. بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 129 × جم لمدة 4 دقائق ، وشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات برفق في المتوسط. حدد عدد الخلايا باستخدام عداد خلايا تلقائي. لوحة 9,000 خلية / بئر في لوحة منخفضة الالتصاق على شكل حرف V ذات 96 بئر.
7. قم بالطرد المركزي للوحة عند 163 × جم لمدة 3 دقائق. باستخدام ماصة، قم بتغيير 50٪ من الوسط كل يومين عن طريق إزالة نصف الوسط واستبداله بوسط تمايز جديد محدد كيميائيا 1 (DM1; الشكل 1 ؛ جدول المواد) لمدة 14 يوما.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تخطيطي يحدد الخطوات المبكرة في إعداد SFEBs. بعد حصاد iPSCs باستخدام تفكك إنزيمي, يتم طلاؤها في 96 لوحات بئر والطرد المركزي في 163 × ز ل 3 دقائق للحث على التجميع السريع. بعد 14 يوما ، يمكن نقل مجاميع الخلايا في المختبر (DIV) من ألواح 96 بئرا عبر ماصات واسعة التجويف إلى ألواح 6 آبار تحتوي على ثقافة الخلية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات SFEB التمايز العصبي وسائل الإعلام لثقافة الخلايا. الكواشف. مكونات وسيط الحث العصبي STEMdiff (وسائط hiPSC) تقنيات STEMCELL 0-5835 250 مل PluriQ ES-DMEM متوسط (MEF Media) جلوبال ستيم جي إس إم-2001 مكونات وسائط DM1 D-MEM / F-12 (1X) ، سائل Glutamax ، 1: 1 إنفيتروجين 10565018 385 مل استبدال مصل خروج المغلوب إنفيتروجين 10828028 20٪ 100 مل القلم / البكتيريا العقدية إنفيتروجين 15140122 5 مل جلوتاماكس 200 ملم إنفيتروجين 35050061 5 مل محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM 10 ملم (100X) ، سائل إنفيتروجين 11140050 5 مل 2-ميركابتو إيثانول (1,000X) ، سائل إنفيتروجين 21985023 900 أولتر جزيئات صغيرة Y27632 (روكي) ستيمجنت 04-0012-10 10 ميكرومتر المكونات / المواد الخلايا الليفية الجنينية للفأر جلوبال ستيم جي اس سي-6301 جي 96 بئر V قاع مع أغطية دائمه الخضره 222-8031-01 فولت كاشف تفكك الخلايا StemPro Accutase ثيرموفيشر A1110501 6 قاع مسطح جيدا صقر 353046