تطوير وصيانة الأجسام الجنينية الخالية من المصل

الملخص

المصدر: Phillips، A. W. ، et al. تطوير أجسام جنينية خالية من المصل مشتقة من HiPSC لاستجواب مزارع الخلايا الجذعية ثلاثية الأبعاد باستخدام فحوصات ذات صلة من الناحية الفسيولوجية. J. Vis. Exp. (2017).

يصف الفيديو إجراء تطوير الأجسام الجنينية الخالية من المصل (SFEBs) من الخلايا السلفية العصبية باستخدام وسائط تمايز مختلفة خالية من المصل أو DM. يسهل DM-2 نضوج الخلايا العصبية وترتيبها لتشكيل SFEBs ، بينما يستخدم DM-3 لمزيد من الحفاظ على النمو.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحريض الجسم الجنيني الخالي من المصل (SFEB) (الشكل 1)

1. ضع إدخالات ثقافة الخلايا 40 ميكرومتر في ألواح ذات 6 آبار وأضف 1 مل من وسط التمايز 1 (DM1) (جدول المواد) لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل إضافة الركام.
2. انقل مجاميع الخلايا السلفية العصبية بوسط 20 ميكرولتر باستخدام طرف فم بعرض 200 ميكرولتر إلى إدخالات ثقافة خلية 40 ميكرومتر وقم بتغيير الوسط إلى DM2 (جدول المواد).
   ملاحظه: إدخالات زراعة الخلايا عبارة عن إدخالات متخصصة تقع قليلا بعيدا عن قاع البئر وتتكون من غشاء بولي تترافلورو إيثيلين معلق عبر إطار بلاستيكي. هذا الغشاء متوافق حيويا ويمكنه الحفاظ على نقل المغذيات والأكسجين بكفاءة إلى SFEBs الموضوعة في الأعلى. يتم استخدامها بشكل شائع مع مزارع شرائح الحصين العضوية المأخوذة من الفأر أو الفأر.
   1. انقل 4-6 مجاميع إلى إدراج ثقافة خلية واحدة والسماح بمساحة كافية بين الركام. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المحلول الزائد باستخدام طرف ماصة رفيع (على سبيل المثال، طرف 200 ميكرولتر).
      ملاحظة: من المقبول إزعاج SFEB لفترة وجيزة لأنها ستتحرك على إدراج ثقافة الخلية أثناء إزالة المحلول من حول SFEBs.
   2. حافظ على المزارع في 1 مل من DM2 عند 37 درجة مئوية ، 95٪ رطوبة و 5٪ CO2. باستخدام ماصة ، قم بتغيير 75٪ من الوسط كل يومين عن طريق إزالة ثلاثة أرباع الوسط واستبداله بثلاثة أرباع وسط طازج. على سبيل المثال ، قم بإزالة 750 ميكرولتر من الوسط وأضف 750 ميكرولتر من الوسط الطازج.
3. بعد 14 يوما من الاستزراع ، قم بالتبديل إلى وسيط DM3 (جدول المواد) مع تغيير متوسط بنسبة 75٪ كل يومين ولمدة 16 يوما أخرى.
4. للحفاظ على SFEBs على إدخالات زراعة الخلايا لأكثر من 30 يوما ، قم بتغيير الوسيط كل يومين لمدة 60 و 90 و 120 يوما.
   ملاحظه: ستنمو SFEBs إلى حوالي 1,000 ميكرومتر في القطر وعادة ما يكون سمكها 100-150 ميكرومتر.
5. افصل SFEBs عن الملحق عن طريق سحب الوسط برفق باستخدام طرف ماصة واسع الفم سعة 200 ميكرولتر. لنقل SFEBs، استخدم طرف ماصة واسع الفم لشفط الأجسام برفق في طرف الماصة. بعد تحميل SFEB في طرف الماصة ، انقلها برفق إلى ألواح ذات 12 بئرا واغسلها بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 300 ميكرولتر لكل بئر.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: الجدول الزمني للتغيرات والمراحل المتوسطة أثناء نمو وتوسع SFEB.

< p class = "jove_content" >بعد نقل SFEBs إلى إدخالات ، يخضعون لتغييرين متوسطين في 14 و 28 يوما في المختبر (DIV). يتم حصادها عادة للتجارب في DIV 30 و 60 و 90. تظهر الأجزاء العلوية مراحل مختلفة في هذه العملية. أشرطة المقياس = 1,000 ميكرومتر (أقصى اليسار) ؛ 1,000 ميكرومتر (DIV 20) ؛ 600 ميك...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات SFEB التمايز العصبي وسائل الإعلام لثقافة الخلايا. الكواشف. مكونات وسيط الحث العصبي STEMdiff (وسائط hiPSC) تقنيات STEMCELL 0-5835 250 مل PluriQ ES-DMEM متوسط (MEF Media) جلوبال ستيم جي إس إم-2001 مكونات وسائط DM1 D-MEM / F-12 (1X) ، سائل Glutamax ، 1: 1 إنفيتروجين 10565018 385 مل استبدال مصل خروج المغلوب إنفيتروجين 10828028 20٪ 100 مل القلم / البكتيريا العقدية إنفيتروجين 15140122 5 مل جلوتاماكس 200 ملم إنفيتروجين 35050061 5 مل محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM 10 ملم (100X) ، سائل إنفيتروجين 11140050 5 مل 2-ميركابتو إيثانول (1,000X) ، سائل إنفيتروجين 21985023 900 أولتر مكونات وسائط DM2 D-MEM / F-12 (1X) ، سائل Glutamax ، 1: 1 إنفيتروجين 10565018 500 مل جلوتاماكس 200 ملم إنفيتروجين 35050061 5 مل القلم / البكتيريا العقدية إنفيتروجين 15140122 5 مل مكمل N-2 (100X) ، سائل إنفيتروجين 17502048 10 مل مكونات وسائط DM3 NEUROBASAL متوسط (1X) ، سائل إنفيتروجين 21103049 500 مل مكمل B-27 ناقص فيتامين أ (50X)، سائل إنفيتروجين 12587010 10 مل جلوتاماكس 200 ملم إنفيتروجين 35050061 5 مل القلم / البكتيريا العقدية إنفيتروجين 15140122 5 مل المكونات / المواد ميليسيل PICM0RG50 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثيرموفيشر 10010023 500 مل