بناء دوائر عصبية منقوشة على مصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية

الملخص

المصدر: Kanner، S.، et al. التصميم والمعالجة السطحية والطلاء الخلوي وزراعة الشبكات العصبية المعيارية المكونة من دوائر مترابطة وظيفيا. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو عملية زراعة الخلايا العصبية على مصفوفة منقوشة متعددة الأقطاب الكهربائية (MEA) لإنشاء شبكات عصبية معيارية. تسمح هذه الطريقة بدراسة نقل الإشارات العصبية والتفاعلات الخلوية.

البروتوكول

فئة

1. إعداد مصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية (MEA)

1. Clean MEA بهذا الترتيب (جدول المواد):
   1. يغسل بالماء تحت الصنبور وصوتي في منظف إنزيمي مركز 3 مرات.
   2. سونيكات في الماء المقطر 3 مرات.
   3. يغسل بالماء المقطر (في الغطاء ، طرف 1,000 ميكرولتر) لمدة 3 مرات ويوضع تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 30 دقيقة.
2. دعم إعداد الشبكة:
   1. قم بإعداد قالب شبكة الدعم المصمم.
      1. صب بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS) في صفيحة من 12 بئرا (قطر 22 مم).
      2. عندما يتم تقوية PDMS ، قم بإزالة القالب ، وباستخدام مشرط ، قم بقطع ثقب في المنتصف لإنشاء شكل حلقة.
      3. ضع قالب شبكة دعم مصمم في وسط MEA (الشكل 1 أ) وقم بتغطية باقي السطح ب poly-D-lysine (PDL) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (RT).
   2. قم بإزالة PDL باستخدام ماصة واغسلها بالماء المقطر.
   3. قم بإزالة القالب واتركه حتى يجف (الشكل 1 أ).
3. قم بمحاذاة الاستنسل مع MEA بالطريقة التالية:
   1. ضع الاستنسل على المعالج الدقيق المخصص. استخدم مجهرا مقلوبا لمحاذاة الهيكل المزخرف بدقة مع الأقطاب الكهربائية وخفض الاستنسل حتى يتم وضعه على سطح MEA (الشكل 1B).
      ملاحظه: يوفر الاتصال بمنطقة الشرق الأوسط وأفريقيا التي تم تنظيفها جيدا التصاق تنافسي بين نظام إدارة الإطارات ومنطقة الشرق الأوسط وأفريقيا نفسها.
   2. ارفع المعالج الدقيق ، وإذا لزم الأمر ، استخدم الملقط لتطبيق كمية صغيرة من الضغط فوق PDMS لمنعه من الانفصال عن MEA.
   3. اضغط برفق على الاستنسل على سطح MEA ، واستخدم مجهرا للتحقق من أنه متصل بإحكام ومحاذاة جيدة (الشكل 1C-D).
4. ضع MEA في غرفة مفرغة لمدة 15 دقيقة ؛ ضع قطرة 1 مل من PDL على الاستنسل.
5. أدخل في غرفة التفريغ 2 مرات لمدة 20 دقيقة لكل منهما. اترك PDL حتى يجف O / N في الحاضنة.
6. قبل الطلاء ، قم بإزالة استنسل PDMS من MEAs واغسلها بالماء المعقم. ضعه تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية لمدة 7 دقائق.

< ص الفئة = "jove_title" >2. الطلاء

1. احسب عدد الخلايا اللازمة للطلاء باستخدام مقياس كثافة الدم
   1. تأكد من نظافة غرفة العد (مقياس الدم) وضع غطاء عليها (استخدم الكحول للتنظيف).
   2. تمييع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في 190 ميكرولتر من وسط الطلاء (التخفيف 1:20).
   3. قم بتحميل 10 ميكرولتر من الخلايا المخففة على حافة غرفة العد وقم بإخراج الخلايا ببطء ، مما يسمح للغرفة بملء نفسها.
   4. باستخدام مجهر مقلوب ، تصور شبكة مقياس الدم. حدد عدد الخلايا في الغرفة عن طريق العد المباشر (يجب أن تكون الخلايا السليمة مستديرة). عد الخلايا داخل المربع الكبير دون أن تعبر تلك الحواف.
   5. احسب تركيز الخلايا:
      إجمالي عدد الخلايا / 1000 ميكرولتر = إجمالي الخلايا التي تم عدها × عامل التخفيف × 10⁴ (مساحة مقياس الدم).
      ملاحظه: على سبيل المثال ، إذا كان عامل التخفيف 20 وكان إجمالي الخلايا التي تم عدها 100:
      100 × 20 × 10⁴ = 0.1 × 10⁷ خلايا / 1,000 ميكرولتر أو 1 × 10⁶/100 ميكرولتر. من أجل صفيحة 0.75 × 10⁶ خلايا ، أخرج 75 ميكرولتر من الخلايا.
2. خذ عدد الخلايا اللازمة للطلاء لكل طبق MEA أو Petri واحد ، وأعد تعليق الخلايا لمنع التراكم ، وقم بوضعها في المنتصف ، أعلى المنطقة المزخرفة (يمكن تخفيف الخلايا في الوسط إذا لزم الأمر). بالنسبة إلى منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا، ضع قطرة 100 ميكرولتر في المنتصف. بالنسبة للغطاء ، ضع قطرة 1,000 ميكرولتر في المنتصف.
3. احتضان الخلايا المطلية عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. أضف وسط الطلاء إلى الخلايا المطلية ، حتى 1 مل لكل MEA و 2 مل لكل غطاء غطاء.
4. يحفظ في درجة حرارة 37 درجة مئوية ويخفف بوسط نمو طازج غني ب 0.5 Pen-Strep و 2٪ B-27 و 0.75٪ glutamax كل 4 أيام.
5. من 6/7 DIV ، بعد رؤية الوصلات بين الجزر ، قم بتخفيف الوسط ب 10 ميكرولتر / مل FUDR (25 مجم ديوكسيوريدين + 62.5 مجم يوريدين في 12.5 مل MEM (الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسي)) أو أي عامل آخر مضاد للانقسام لمنع فرط النمو الدبقي.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. ترسيب هياكل PDMS على MEA. (أ) قالب PDMS على شكل حلقة (مميز بالسهم الأحمر) مركب على MEA. يستخدم القالب لتغطية المنطقة المخصصة للشبكة العصبية الداعمة وتقع على محيط منطقة الاستزراع (يقتصر هذا على الحلقة المثبتة على منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا وتتميز بالسهم الأخضر). (ب) محاذاة استنسل PDMS على MEA باستخدام معالج دقيق. (ج) استنسل PDMS المودع في MEA ب...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات PDMS ، سيلجارد 184 داو كورنينج غرفة فراغ Nalgene الحراريه 5305-0609 بولي د-يسين PDL سيغما P7886 12 لوحة ثقافة بئر سيغما CLS3336 5-فلورو-2'-ديوكسي يوريدين سيغما F0503 MEA1060-Inv-BC أنظمة متعددة القنوات تي سي 02 أنظمة متعددة القنوات القلم Strep الصناعات البيولوجية بيت هيمك 03-033-1 ج ب -27 جيبكو 17504044 جلوتا ماكس جيبكو 35050-038 MEM الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسي الصناعات البيولوجية بيت هيمك 01-025-1 ب مصفوفات القطب الكهربائي الصغير 4Q أنظمة متعددة القنوات 60-4QMEA1000iR-Ti-pr دليل التنظيف: http://www.multichannelsystems.com