مقالة منهجية

تمييز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية إلى خلايا عصبية حركية وظيفية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Garone, M.G., et al. تحويل الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة عن طريق الإنسان (iPSCs) إلى الخلايا العصبية الحركية الشوكية والجمجمة الوظيفية باستخدام ناقلات PiggyBakc. J. Vis. Exp. (2019).

< ص الفئة = "jove_content">يعرض هذا الفيديو عملية تمييز iPSCs البشرية إلى الخلايا العصبية الحركية. يتضمن الأساس المنطقي استخدام iPSCs التي تم تعديلها وراثيا للتعبير عن عوامل نسخ محددة. عندما استزراع في وسائط تحتوي على دوكسيسيكلين, هذا المضاد الحيوي يؤدي إلى التعبير عن عوامل النسخ, وبالتالي تعزيز التمايز iPSC إلى أسلاف الخلايا العصبية الحركية. في النهاية ، يتم استزراع الأسلاف في وسط عصبي لإنتاج خلايا عصبية حركية ناضجة ووظيفية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. صيانة iPSCs البشرية

  1. تحضير الألواح المطلية بالمصفوفة
    1. قم بإذابة قارورة مصفوفة سعة 5 مل (انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تأتي مخزونات المصفوفة الأصلية بتركيزات مخزون مختلفة ، ويتم إجراء الحصص وفقا لعامل التخفيف الموضح في ورقة البيانات وهي خاصة بالدفعة الفردية. من الأهمية بمكان الحفاظ على القارورة والأنابيب باردة لمنع التبلور المبكر للمصفوفة. قم بتوزيع المصفوفة في الأنابيب المبردة مسبقا على الجليد. قم بتجميد الحصص غير المستخدمة عند -20 درجة مئوية.
    2. ضع قطعة واحدة على الجليد لمدة 2 ساعة تقريبا حتى تذوب.
    3. قم بتخفيف كمية المصفوفة ب 20 مل من DMEM / F12 البارد في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
    4. تخلط جيدا وتحفز 1 مل من المصفوفة المخففة في أطباق 35 مم (كميات مكافئة لكل مساحة من الأطباق الأخرى).
    5. احتفظ بالأطباق التي تحتوي على مصفوفة مخففة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح بالطلاء.
      ملاحظه: يمكن تخزين الأطباق ، المختومة بالبارافيلم ، عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  2. تحضير محلول المخزون (20 مل) و 1x حصة عمل من كاشف تفكك الخلية اللطيف (انظر جدول المواد).
    1. يذوب المسحوق إلى 10 مجم / مل في PBS (Ca2 + / Mg2+ مجانا)
    2. تعقيم المرشح من خلال غشاء مرشح 0.22 ميكرومتر.
    3. قم بإعداد 20 قطعة (1 مل لكل منها) وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
    4. قبل الاستخدام ، قم بتخفيف كمية واحدة في PBS (Ca2 + / Mg2+ مجانا) إلى 1 مجم / مل (1x حصصات عاملة).
      ملاحظة: يمكن تخزين 1x حصص العمل عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين.
  3. تمرير iPSCs البشرية.
    1. قبل البدء: إذا تم تخزينها في 4 درجة مئوية, قبل تسخين لوحات مصفوفة المغلفة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ل 20-30 دقيقة. قم بتسخين DMEM / F12 مسبقا.
    2. وسط ثقافة الشفط.
    3. اشطف iPSCs باستخدام PBS (Ca2+/Mg2+ مجانا).
    4. أضف 1x محلول تفكك لطيف (0.5 مل لطبق 35 مم). احتضن عند 37 درجة مئوية حتى تبدأ حواف المستعمرات في الانفصال عن اللوحة ، عادة 3-5 دقائق.
    5. استنشاق حل التفكك لطيف, مع الحرص على عدم فصل مستعمرات iPSC.
    6. اغسل الخلايا ب DMEM / F12 (2 مل لطبق 35 مم) والشفط ، مع الحرص على عدم فصل الخلايا. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
    7. أضف متوسط iPSC البشري (1 مل لطبق 35 مم).
    8. افصل المستعمرات برفق باستخدام رافع الخلايا وانقلها إلى أنبوب سعة 15 مل.
    9. قم بكسر كتل الخلايا برفق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P1000 3-4 مرات.
    10. استنشق المادة الطافية من اللوحة (الصفائح) المطلية بالمصفوفة.
    11. بذر الخلايا في حجم الثقافة المناسب لوسط iPSC البشري. يمكن أن تختلف نسبة الانقسام من سطر إلى آخر وتكون حوالي 1: 4-1: 8. قم بتغيير الوسيط يوميا.
فئة

2. توليد خطوط iPSC المحفزة NIL و NIP

  1. تعداء الخلية
    1. اشطف الخلايا باستخدام PBS (خال من Ca2 +/Mg2+).
    2. أضف كاشف تفكك الخلية (انظر جدول المواد) (0.35 مل لطبق 35 مم) واحتضانه عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل الخلايا المفردة (5-10 دقائق).
    3. أكمل فصل الخلايا برفق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P1000 3-4 مرات.
    4. اجمع في أنبوب سعة 15 مل وأضف PBS (Ca2 + / Mg2+ مجانا) إلى 10 مل. عد الخلايا.
    5. بيليه 106 خلايا وإعادة تعليقها في 100 ميكرولتر من Buffer R (مضمنة في مجموعة التثقيب الكهربائي للخلية ؛ انظر جدول المواد).
    6. أضف الحمض النووي البلازميد للتعداد: 4.5 ميكروغرام من الناقل القابل للنقل (epB-Bsd-TT-NIL أو epB-Bsd-TT-NIP12) و 0.5 ميكروغرام من بلازميد الترانسبوزيت piggyBac.
    7. قم بعمل شفاف مع نظام التثقيب الكهربائي للخلية (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وكما هو موضح سابقا مع المعلمات التالية: جهد 1,200 فولت ، عرض 30 مللي ثانية ، نبضة واحدة. زرع الخلايا في وسط iPSC بشري مكمل ب 10 ميكرومتر Y-27632 (مثبط ROCK ، انظر جدول المواد) في طبق مطلي بمصفوفة 6 مم.
  2. الاختيار بالمضادات الحيوية
    1. بعد يومين من التعدي ، أضف 5 ميكروغرام / مل بلاستيسيدين إلى وسط الاستزراع.
    2. تموت معظم الخلايا غير المنقولة في غضون 48 ساعة من اختيار مبيد البلاست. احتفظ بالخلايا في بلاستيسيدين لمدة 7-10 أيام على الأقل لتحديد الخلايا التي لم تدمج الجينات المعدلة وراثيا في الجينوم.
    3. الحفاظ على الخلايا المنقولة بثبات كمجموعة مختلطة ، تتكون من خلايا ذات أعداد مختلفة من الجينات المعدلة ومواقع تكامل مختلفة ، أو عزل المستنسخة المفردة.
    4. قم بإعداد طبق إضافي للتحقق من التعبير الفعال للجينات المعدلة وراثيا عند تحريض 1 ميكروغرام / مل من الدوكسيسيكلين بواسطة RT-PCR مع بادئات خاصة بالجينات المعدلة وراثيا ل Ngn2 (إلى الأمام: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; العكس: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT).
    5. في هذه المرحلة, تجميد مخزونات النوادي NIL- و NIP-iPSC خطوط في وسط تجميد ل iPSCs البشرية (انظر جدول المواد).
فئة

3. تمايز الخلايا العصبية الحركية

  1. فصل الخلايا عن كاشف تفكك الخلية كما هو موضح (الخطوات 2.1.1.-2.1.3.). اجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب سعة 15 مل وقم بتخفيفها ب 5 أحجام من DMEM / F12. بيليه الخلايا وإعادة تعليقها في وسط iPSC بشري مكمل بمثبط 10 ميكرومتر ROCK. عد الخلايا والبذور على أطباق مغلفة بالمصفوفة بكثافة 62,500 خلية / سم2.
  2. في اليوم التالي ، استبدل الوسط ب DMEM / F12 ، مكملا بنظير L-glutamine مستقر 1x ، مكمل زراعة خلايا الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) و 0.5x البنسلين / الستربتومايسين ، يحتوي على 1 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين. يعتبر هذا اليوم 0 من التمايز. في اليوم 1 ، قم بتحديث الوسط والدوكسيسيكلين.
  3. في اليوم 2 ، قم بتغيير الوسط إلى وسط عصبي قاعدي / B27 (الوسط العصبي القاعدي المكمل ب 1x B27 ، 1x تناظري L-glutamine مستقر ، 1x NEAA و 0.5x البنسلين / الستربتومايسين) ، يحتوي على 5 ميكرومتر DAPT ، 4 ميكرومتر SU5402 ، و 1 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين (انظر جدول المواد). قم بتحديث الوسط والدوكسيسيكلين كل يوم حتى اليوم 5.
  4. اليوم 5: تفكك الخلايا مع كاشف تفكك الخلية (انظر جدول المواد).
    1. اشطف الخلايا باستخدام PBS (خال من Ca2 +/Mg2+).
    2. أضف كاشف تفكك الخلية (0.35 مل لطبق 35 مم) واحتضنه عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل الطبقة الأحادية للخلية بأكملها عن الطبق.
      لاحظ أنه لن يتم فصل الخلايا المفردة أثناء الحضانة.
    3. أضف 1 مل من DMEM / F12 واجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 مل.
    4. أكمل فصل الخلايا برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P1000 10-15 مرة.
    5. أضف 4 مل من DMEM / F12 وعد الخلايا.
    6. في هذه المرحلة ، قم بتجميد أسلاف الخلايا العصبية الحركية في وسط تجميد الخلايا (انظر جدول المواد) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    7. بيليه الخلايا وإعادة تعليقها في الوسط العصبي (وسط عصبي / B27 مكمل ب 20 نانوغرام / مل BDNF ، و 10 نانوغرام / مل GDNF ، و 200 نانوغرام / مل حمض الأسكوربيك ، انظر جدول المواد) مع استكمال مثبط 10 ميكرومتر ROCK.
    8. قم بزرع الخلايا على بولي أورنيثين / لامينين - أو بدلا من ذلك على دعامات مغلفة بالمصفوفة بكثافة 100,000 خلية / سم2. استخدم دعامات بلاستيكية μ-Slide مع غطاء بوليمر (انظر جدول المواد) لتحليل التلوين المناعي.
  5. في اليوم 6 ، قم بتغيير الوسط العصبي المتوسط إلى الوسط العصبي الجديد الخالي من مثبطات ROCK. في الأيام التالية ، قم بتحديث نصف الوسيط كل 3 أيام. يجب تغيير وسط الثقافة بعناية فائقة لمنع الانفصال عن السطح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أكوتاز سيجما ألدريتش A6964-100 مل كاشف تفكك الخلية ب 27 ميلتيني بيوتيك 130-093-566 مكمل غذائي خال من المصل للحفاظ على الخلايا العصبية بامبانكر علم الوراثة نيبون NGE-BB02 وسط تجميد الخلايا ، يستخدم هنا لأسلاف الخلايا العصبية الحركية BDNF PreproTech 450-02 عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ بلاستيسيدين سيجما ألدريتش هاتف: 203350 مضاد حيوي نيوكليوزيد يثبط تخليق البروتين في بدائيات النوى وحقيقيات النوى جيش صرب البوسنه سيجما ألدريتش أ 2153 ألبومين مصل البقر. عامل مانع لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة في فحوصات التلوين المناعي كلوريدالهواء 2 سيجما ألدريتش سي 3881 المواد الكيميائية للحلول الفيزيولوجية الكهربية مصفوفة كورنينج ماتريجل hESC المؤهلة كورنينج 354277 المواد الكيميائية للحلول الفيزيولوجية الكهربية وسائط تجميد ACF CRYOSTEM الصناعات البيولوجية 05-710-1ه وسط التجميد ل iPSCs البشرية د-جلوكوز سيجما ألدريتش جي 5146 المواد الكيميائية للحلول الفيزيولوجية الكهربية DAPT أديبوجين AG-CR1-0016-M005 مثبط سكريتيز جاما متباينة جيبكو 17105-041 كاشف للتفكك اللطيف لمركبات iPSCs البشرية DMEM / F12 سيجما ألدريتش D6421-500 مل الوسط القاعدي لزراعة الخلايا الدوكسيسيكلين سيجما ألدريتش D9891-1G تستخدم للحث على التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا من نواقل epB-Bsd-TT-NIL و epB-BSD-TT-NIP DS2U واي سيل UWWC1-DS2U خط iPSC البشري التجاري GDNF PreproTech 450-10 عامل التغذية العصبية المشتق من الدبقي خط Gibco episomal hiPSC ثيرمو فيشر العلمي أ 18945 خط iPSC البشري التجاري جلوتاماكس ثيرمو فيشر العلمي 35050038 بديل ل L-glutamine مع زيادة الاستقرار. يحسن صحة الخلايا. هيبس سيجما ألدريتش إتش 4034 المواد الكيميائية للحلول الفيزيولوجية الكهربية حمض الأسكوربيك مختبرات LKT أ 7210 يستخدم في زراعة الخلايا كمضاد للأكسدة لامينين سيجما ألدريتش 11243217001 يعزز تعلق ونمو الخلايا العصبية في المختبر NEAA ثيرمو فيشر العلمي 11140035 الأحماض الأمينية غير الأساسية. تستخدم كمكمل لوسط زراعة الخلايا ، لزيادة نمو الخلايا وقابليتها للحياة. طقم نيون 100 ميكرولتر ثيرمو فيشر العلمي MPK10096 طقم التثقيب الكهربائي للخلايا نظام تعداء النيون ثيرمو فيشر العلمي MPK5000 نظام التثقيب الكهربائي للخلية الوسط العصبي القاعدي ثيرمو فيشر العلمي 21103049 وسط قاعدي مصمم للصيانة والنضج على المدى الطويل لمجموعات الخلايا العصبية دون الحاجة إلى طبقة مغذية للخلايا النجمية NutriStem-XF / FF الصناعات البيولوجية 05-100-1 أ وسيط ثقافة iPSC البشري برنامج تلفزيوني سيجما ألدريتش د8662-500 مل محلول ملحي للفوسفات من Dulbecco ، مع الكالسيوم ، مع المغنيسيوم برنامج تلفزيوني Ca2 + / Mg2 + مجانا سيجما ألدريتش D8537-500 مل محلول ملحي للفوسفات من Dulbecco ، بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيوم البنسلين / الستربتومايسين سيجما ألدريتش P4333-100 مل يستخدم محلول البنسلين / الستربتوميسين لمنع تلوث زراعة الخلايا من البكتيريا. بولي أورنيثين سيجما ألدريتش ص 4957 يعزز تعلق ونمو الخلايا العصبية في المختبر SU5402 سيجما ألدريتش SML0443-5 ملغ مثبط انتقائي لمستقبلات عامل النمو البطاني الوعائي 2 (VEGFR-2) تريتون X-100 سيجما ألدريتش تي 8787 4- (1،1،3،3-Tetramethylbutyl) فينيل- بولي إيثيلين جلايكول ، ر- أوكتيل فينوكسي بولي إيثوكسي إيثانول ، بولي إيثيلين جلايكول ثلاثي - أوكتيل الفينيل الأثير. تستخدم لنفاذية الخلية في فحوصات التلوين المناعي Y-27632 (مثبط الصخور) إنزو لعلوم الحياة ألكس-270-333-M005 مثبط انتقائي منفذ للخلية لملف ملفوف مرتبط ب Rho يحتوي على بروتين كيناز (ROCK). يزيد من بقاء iPSC μ-الشريحة 8 جيدا المرجع نفسه 80826 دعم التحليل المجهري المتطور للخلايا الثابتة

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Human iPSCsMotor Neuron DifferentiationDoxycycline InductionTranscription Factor ExpressionCell DissociationROCK InhibitorNeuronal MediumPiggyBac VectorsProgenitor MaturationFunctional Motor Neurons

مقالات ذات صلة