توليد نموذج ثقافة مشتركة ثلاثية الأبعاد للأرومات الليفية والقرنية البشرية والخلايا العصبية

الملخص

المصدر: Sharif, R., et al. هندسة أنسجة القرنية: نموذج في المختبر لتفاعلات الأعصاب اللحمية للقرنية البشرية. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو تقنية لإنشاء نظام نموذج زراعة مشترك ثلاثي الأبعاد للأرومات الليفية القرنية البشرية الأولية والخلايا العصبية المتمايزة. يمكن استخدام نظام الزراعة المشتركة هذا لدراسة تفاعلات الأعصاب اللحمة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. HCFs الأولية (الخلايا الليفية للقرنية البشرية) الثقافة وجمعية الإنشاءات ثلاثية الأبعاد

1. لتجميع تركيبات ثلاثية الأبعاد من النباتات المزروعة سابقا في EMEM 10٪ FBS 1٪ مضاد حيوي / مضاد للفطريات ، ومرور وعد HCFs.
2. قم بزرع ما يقرب من 1 × 10⁶ خلايا / بئر من HCFs الأولية على إدراج غشاء البولي كربونات مع مسام 0.4 ميكرومتر من التركيبات ثلاثية الأبعاد ، جنبا إلى جنب مع 1.5 مل من EMEM الطازج 10٪ FBS 1٪ مضاد حيوي / مضاد للفطريات إلى الجزء العلوي من البناء. أضف 1.5 مل أخرى من نفس الوسائط إلى أسفل كل بناء.
3. بعد 24 ساعة من بذر الخلايا ، قم بزراعة الخلايا باستخدام EMEM 10٪ FBS 1٪ مضاد حيوي / مضاد للفطريات ، محفز بحمض الأسكوربيك 0.5 ملي مولار 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic (فيتامين C) عن طريق إضافة 1.5 مل في الأعلى و 1.5 مل في الجزء السفلي من كل بناء.
4. الحفاظ على المزارع في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} لمدة 3 أسابيع وتوفير وسائط جديدة كل يومين خلال فترة الدراسة بأكملها. ليست هناك حاجة إلى مزيد من المسار.

< p class = "jove_title" >2. تمايز الخلايا والثقافات المشتركة

1. بعد 3 أسابيع ، أضف 8 × 10³ خلايا / بئر من خلايا الورم الأرومي العصبي البشري SH-SY5Y في الجزء العلوي من التركيبات ثلاثية الأبعاد التي تم تجميعها مسبقا والتي تحتوي على 1.5 مل من EMEM التي تحتوي على 10٪ FBS ، و 1٪ مضاد حيوي / مضاد للفطريات ، و 0.5 ملي مولار 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid (فيتامين C).
   1. اسمح لخلايا الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y بالنمو فوق الخلايا اللحمية للقرنية لمدة 24 ساعة على الأقل قبل البدء في تمايز الخلايا.
2. ابدأ تمايز خلايا SH-SY5Y عن طريق تحفيز الخلايا مع EMEM التي تحتوي على 1٪ FBS و 1.5 مل من 10 ميكرومتر من حمض الريتينويك أعلى البناء. أضف 1.5 مل من EMEM 10٪ FBS 1٪ مضاد حيوي / مضاد للفطريات 0.5 ملي مولار 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid (فيتامين C) إلى قاع البنية. لاحظ أنه يجب تنفيذ خطوة حمض الريتينويك في الظلام.
   1. استمر في زراعة الخلايا في وسط التمايز هذا لمدة 5 أيام.
3. عندما تصل الخلايا إلى مرحلة التمايز ، قم بتبديل الخلايا إلى 1.5 مل من الوسائط الخالية من المصل التي تحتوي على 2 نانومتر من عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) و 1٪ مضاد حيوي / مضاد للفطريات مضاف إلى EMEM ، عن طريق الإضافة إلى الجزء العلوي من البناء. أضف 1.5 مل من EMEM 10٪ FBS 1٪ مضاد حيوي / مضاد للفطريات 0.5 ملي مولار 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid (فيتامين C) إلى قاع البنية. لاحظ أنه يجب تنفيذ خطوة BDNF في الظلام.
4. استزراع الخلايا لمدة يومين إضافيين قبل المعالجة لمزيد من التحليل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات محلول الفوسفات المخزن (1X) من Dulbecco جيبكو من لايف تكنولوجيز 14190-144 ملقط معقم فيشر العلمية 13-812-42 Fisherbrand تشريح ملقط منشق مدبب ناعم للغاية شفرات حلاقة أحادية الحافة بيرسونا هاتف: 270100 شفرات مشرط جراحية معقمة رقم 10 شفرة جراحية من الريشة 2976 # 10 الحد الأدنى من الوسيط الأساسي للنسر ATCC 30-2003 مصل الأبقار الجنينية أتلانتا بيولوجيكس S11550 مطلوب 10٪ FBS لإعداد الوسائط مضاد حيوي مضاد للفطريات (100X) جيبكو من لايف تكنولوجيز هاتف: 15240-062 مطلوب 1٪ مضاد حيوي - مضاد للفطريات لإعداد الوسائط 0.05٪ تريبسين EDTA (1X) جيبكو من لايف تكنولوجيز 25300062 إدراج غشاء البولي كربونات مع مسام 0.4 ميكرومتر كورنينج كوستار 3412 2-O-α-Dglucopyranosyl-L-حمض الأسكوربيك (فيتامين C) سيجما ألدريتش SMB00390-14 يجب استخدام تركيز 0.5 ملي مولار للدراسة خلايا الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y ATCC SHSY5YATCC CRL-2266 حمض الريتينويك سيجما ألدريتش SRP3014-10UG يجب استخدام التركيز النهائي ل 10uM BDNF سيجما ألدريتش R2625-100 ملغ يجب استخدام التركيز النهائي 2 نانومتر ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) VWR-ألفا إيسار 67-68-5 استخدام DMSO فائق النقاء ثقافة الخلايا الحرارية العلمية المعالجة EasYFlasks (T25) فيشر ساينتيك 12-565-351 ثقافة الخلايا الحرارية العلمية المعالجة EasYFlasks (T75) فيشر ساينتيك 12-565-349