مقالة منهجية

تصوير الكالسيوم في الخلايا العصبية الفردية التي تنظم سلوك وضع البيض في Caenorhabditis elegans

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Ravi، B. et al. ، تصوير الكالسيوم النسبي للخلايا العصبية الفردية في Caenorhabditis Elegans التصرف. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تقنية لتصوير الكالسيوم في الخلايا العصبية الفردية لالتهاب الفلورسنت الذي يتصرف باستخدام بروتينات مراسل الفلورسنت المشفرة وراثيا. يحدد الخطوات المتبعة في تصوير حركة الدودة وقياس نسب التألق المراسل من الخلايا العصبية لربط مستويات الكالسيوم داخل الخلايا بالنشاط العصبي والتغيرات السلوكية أثناء وضع البيض.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. السلالات ووسائط الثقافة وتركيب

  1. تنمو C. ايليجانس الديدان عند 20 درجة مئوية على صفائح أجار قياسية مقاس 60 مم (NGM) مع OP50 بكتريا قولونية غذائية بكتيرية.
  2. قم بإعداد بلازميدين لكل محفز خاص بالخلية محل اهتمام: أحدهما ، دفع التعبير عن GCaMP5 لتسجيل Ca2+ داخل الخلايا ، والثاني ، التعبير الدافع ل mCherry للسماح بالقياس الكمي النسبي لتغيرات مضان GCaMP5 وتبسيط العثور على الكائن وقياسه.
    ملاحظه: GCaMP5: mCherry يصحح التصوير النسبي القياسي التقلبات في مضان GCaMP5 الناتجة عن التغيرات في التركيز وحركة ، وليس التغيرات الفعلية في Ca2+ داخل الخلايا.
  3. قم بحقن البلازميدات التي تعبر عن GCaMP5 و mCherry جنبا إلى جنب مع بلازميد علامة الإنقاذ المرئية pL15EK في الغدد التناسلية للحيوانات الطافرة LX1832 lite-1 (ce314) و lin-15 (n765ts) X واسترجع غير Muv lin-15 (+) التي تعبر عن GCaMP5 و mCherry من جين معدل عالي النسخة. استخدم الخلفية المتحولة lite-1 لتقليل سلوك تجنب الضوء الأزرق.
  4. دمج الجينات المعدلة وراثيا في الكروموسومات لتقليل الفسيفساء وتبسيط توليد السلالات الطافرة المركبة.
    ملاحظه: تحمل سلالة LX2004 الموصوفة هنا جينات معدلة وراثية متكاملة عالية النسخة تعبر عن GCaMP5 و mCherry في HSNs من محفز nlp-3 (انظر جدول المواد). تم العثور على محفز nlp-3 لدفع تعبير قوي في HSNs للحيوانات المتأخرة L4 البالغة دون التسبب في عيوب كبيرة في تطور HSN أو سلوك وضع البيض مقارنة بالمروجين الآخرين الذين تم اختبارهم (على سبيل المثال ، tph-1 و egl-6 و unc-86). تتوفر هذه السلالة وغيرها من السلالات التي تعبر عن GCaMP5 و mCherry في الخلايا العصبية الحركية للحبل البطني (VC) ، وعضلات الفرج ، وخلايا الغدد الصم العصبية uv1 من مركز Caenorhabditis لعلم الوراثة ، وقد تم وصف تفاصيل بنائها.
  5. ضع طعاما بكتيريا OP50 من صفيحة أجار NGM المصنفة على قاع دودة البلاتين واستخدمه لنقل ~ 20 متأخرا L4 LX2004 التي تعبر عن GCaMP5 و mCherry في HSNs من مروج nlp-3. تأكد من ظهور الفرج النامي في المجهر المجسم كبقعة داكنة واضحة محاطة بهلال أبيض. احتضان عند 20 درجة مئوية لمدة 24-40 ساعة.
  6. بعد الحضانة ، ضع OP50 على الانتقاء وانقل ~ 3 من الديدان إلى صفيحة NGM غير مصنفة ، تاركا كمية صغيرة من الطعام وراءها لتتغذى عليها الديدان أثناء التصوير. تأكد من طعام كاف ، لأن القليل جدا من الطعام البكتيري سيشجع الديدان على التجول بعيدا عن مركز الطبق ، في حين أن الكثير من الطعام سيزيد من تألق الخلفية ويسبب نقص الأكسجة.
  7. استخدم ملعقة مستديرة مسطحة لقطع قطعة ~ 20 مم × 20 مم من اللوحة التي تحمل الديدان ونقل القطعة ووجهها لأسفل إلى وسط غطاء نظيف مقاس 24 مم × 60 مم # 1.5 (الشكل 1). ابدأ التطبيق من جانب واحد لمنع الفقاعات من الاحتجاز تحت الغطاء والتدخل في التصوير. ضع غطاء مقاس 22 مم × 22 مم # 1 على الجزء العلوي من القطعة لتقليل الالتصاق والتبخر.

2. إعداد الأجهزة والأجهزة

  1. ضع الديدان المعدلة وراثيا على مسرح المجهر المقلوب باستخدام هدف ≥ 0.7 Numerical Aperture Plan - Apochromat 20x ، ومرحلة XY الآلية التي يمكن التحكم فيها باستخدام عصا التحكم ، وفاصل الصور ، ومرشحات مضان للإثارة والانبعاث المتزامن GCaMP5 و mCherry ، وكاميرات للتصوير الفلوري والأشعة تحت الحمراء الساطعة ، ونظام إضاءة الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) القابل للتشغيل (الشكل 2 أ).
    ملاحظة: يرسل مقسم الشعاع بنسبة 80/20 80٪ من إشارة الصورة إلى الكاميرا الفلورية و20٪ إلى كاميرا المجال الساطع. يمكن أيضا استخدام مجهر عمودي ، ولكن يجب وضع قطعة NGM بين شريحة زجاجية والغطاء الكبير في هذه الحالة.
    1. استخدم العدسات المجهرية لتحديد دودة للتصوير. عند اختيار ، حرك مرشح الأشعة تحت الحمراء في مكانه فوق المكثف.
  2. مشغلات منطق الترانزستور والترانزستور (TTL)
    1. قم بتوصيل الكابلات المحورية من كل خط من خطوط إخراج مشغل TTL الثلاثة على الكاميرا الفلورية. قم بتوصيل الإخراج الأول بمدخل BNC # 3 لنظام إضاءة LED.
    2. قم بتوصيل الإخراج الثاني بمحول BNC "الموز" بأسلاك خضراء وبنية من موصل GPIO ذو 8 سنون يعمل إلى مدخل GPIO # 3 (السن 4) والأرض (السن 5) لكاميرا الأشعة تحت الحمراء ، على التوالي.
    3. قم بتوصيل الإخراج الثالث بمحول BNC "الموز" باستخدام أسلاك التوصيل التي تعمل إلى الإدخال الرقمي # 8 والأرض في جهاز الاستحواذ الرقمي (الشكل 2 ب).
  3. جهاز الاستحواذ الرقمي (DAQ)
    1. قم بتوصيل لوحة متحكم DAQ (انظر جدول المواد) بالكمبيوتر عبر كابل USB. قم بتحديث البرنامج الثابت باستخدام بروتوكول Firmata القياسي (انظر جدول المواد) وقم بتكوين منفذ USB للاتصال ب 57600 باود.
  4. المصابيح
    1. قم بتشغيل برنامج وحدة التحكم LED (انظر جدول المواد). قم بتبديل وضع الزناد من "مستمر" إلى "مسور" وحدد قناة الزناد "3" لكل من مصابيح LED 470 و 590 نانومتر.
    2. قم بتشغيل وإدخال طاقة LED لكل LED (على سبيل المثال ، اضبط مؤشر LED 470 نانومتر على 20٪ و 590 نانومتر LED على 40٪).
  5. قم بتشغيل نص الاتصال في المرحلة التسلسلية "XY-stage-final" في بونساي (انظر جدول المواد). انقر فوق العقدة الرمادية "CsvWriter" وحدد مجلدا لحفظ معلومات مرحلة X و Y المسجلة (الشكل 3). اضغط على رأس السهم الأخضر في شريط الأدوات لتهيئة DAQ.
    ملاحظه: سيبدأ البرنامج النصي في تسجيل موضع المرحلة X و Y عندما ترسل الكاميرا الفلورية إشارة TTL. ينتج هذا البرنامج النصي أربعة أعمدة من البيانات: رقم الإطار ، وموضع X (ميكرومتر) ، وموضع Y (ميكرومتر) ، والفاصل الزمني بين الإطارات (الإطارات).
  6. في برنامج تسجيل كاميرا الأشعة تحت الحمراء (راجع جدول المواد)، ضمن "أوضاع الفيديو المخصصة"، حدد "الوضع 1" (2 × 2 binning؛ 1,024 × 1,024 بكسل)، و"تنسيق البكسل Raw 8". ضمن "Trigger / Strobe" ، اضبط خط إدخال الزناد (GPIO) على "3" ، والقطبية إلى "عالية" ، و "الوضع" إلى "14". قم بتبديل "تمكين" لإيقاف الحصول على الإطار حتى يتم تلقي إشارة مشغل TTL.
    1. عند ترك هذه النافذة مفتوحة ، انقر فوق الزر الأحمر "تسجيل" على شريط أدوات عرض الكاميرا الرئيسي. حدد المجلد الخاص بتسلسلات الصور المراد حفظها. حدد وضع التسجيل "Buffered" واحفظ "الصور" بتنسيق JPEG. انقر فوق "بدء التسجيل" لتهيئة عملية الاستحواذ.
  7. كاميرا مضان وصورة الفاصل
    ملاحظه: يجب جمع قنوات مضان GCaMP5 و mCherry في وقت واحد لضمان تسجيل الصورة المناسب للقياس الكمي النسبي. يسمح مقسم الصور بالحصول على قناتين ل GCaMP5 و mCherry المضان على مستشعر واحد.
    1. في علامة التبويب "التقاط" في برنامج الحصول على الصور (انظر جدول المواد) ، اضبط وقت التعرض على 10 مللي ثانية ، والتجميع على 4x ، وعمق الصورة على 16 بت. حدد صفيف فرعي للكاميرا في المنتصف بعرض 512 بكسل وارتفاعه 256 بكسل. انقر فوق "إظهار خيارات مشغل الإخراج" واضبط جميع المشغلات على "إيجابي".
      ملاحظة: يمكن أن يفوت DAQ أحيانا مشغلات TTL إذا كانت 10 مللي ثانية أو أقل.
    2. تأكد من تعيين "المشغل 1" و"المشغل 2" على "التعرض" بينما تم تعيين "المشغل 3" على "قابل للبرمجة" مع "فترة" تبلغ 25 مللي ثانية. ضمن علامة التبويب "التسلسل" ، حدد "الفاصل الزمني" مع "تأخير المجال 1" بمقدار 50 مللي ثانية لجمع الصور عند 20 هرتز.
  8. اكتساب PMT وشدة الليزر أثناء التصوير متحد البؤر ثلاثي القنوات
    1. اضبط كسب PMT بحيث يكون تألق الخلفية عند مستوى أعلى بقليل من الحد الأدنى (المستوى الأسود). قم بزيادة طاقة الليزر 561 نانومتر (الأخضر) حتى يتم ملاحظة بكسل واحد مشبع 12 بت أو 16 بت في الطرف قبل المشبكي في قناة mChery.
    2. اضبط شدة الليزر 488 نانومتر (الأزرق) بحيث يكون مضان GCaMP5 مرئيا فقط عند الطرف قبل المشبكي فوق الخلفية. يمنع هذا الإعداد المنخفض تشبع وحدات البكسل GCaMP5 عندما يزداد التألق استجابة لعابرين Ca2+ قويين. افتح الثقب متحد البؤر بالكامل لزيادة التقاط الضوء إلى أقصى حد.
فئة

3. التصوير النسبيCa 2 + وتسجيل السلوك

  1. ضمن علامة التبويب "تسلسل" في برنامج الحصول على التألق ، انقر فوق "ابدأ" لبدء التسجيل. تتبع الدودة باستخدام عصا التحكم ، مع الحفاظ على الخلية (الخلايا) والمشابك ذات الأهمية في التركيز وفي وسط مجال الرؤية (FOV). انقر فوق الزر "الإحصائيات" في نافذة الرسم البياني لإظهار إحصائيات البكسل لكل قناة.
  2. اضبط طاقة LED لضمان أقصى مضان mCherry أحادي البكسل عند الطرف قبل المشبكي البالغ ≥ 8,000 عدد (~ 4,000 إلكترون ضوئي) ، مما يعطي نطاقا ديناميكيا ~ 12 بت فوق الخلفية (~ 100 إلكترون ضوئي). يجب أن تكون إشارات GCaMP5 في الطرف قبل المشبكي أثناء الراحة (منخفضة) Ca2+ حوالي ~ 2,500 عدد - مرئية فقط فوق الخلفية.
  3. سجل حتى يتم الوصول إلى حالة نشطة واحدة لوضع البيض ؛ عادة ، يحدث هذا كل 20-30 دقيقة في دودة من النوع البري. احفظ مجموعة فرعية مدتها 10 دقائق (12,001 إطارا) ، 6,000 إطار قبل وبعد حدث وضع البيض الأول (الإطار 6,001). تأكد من الاحتفاظ بنفس المجموعة الفرعية من صور المجال الساطع لسلوك الفيروس الدودي والنقاط الزمنية لموضع مرحلة XY ، وإلا ستفقد المزامنة الدقيقة لتدفقات البيانات.
  4. استخدم ImageJ والمكون الإضافي BioFormats (انظر جدول المواد) لتحويل تسلسلات الصور إلى تنسيق معيار قياس الخلايا للصور (.ics) بحيث يمكن استيرادها إلى برنامج Ratiometric Quantitation.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1. C. تقنية تركيب ايليجانس للتصوير عالي الدقة لنشاط وسلوك دائرة وضع البيض.أعلى ، الحامل النهائي من الجانب. أسفل ، الحامل النهائي كما يظهر من خلال الجزء السفلي من الغطاء الكبير. تشير الأسهم إلى طعام بكتيري OP50 ، C. ايليجانس ، الديدان ، والبيض ، محصورة بين قطعة أجار NGM والغطاء الكبير 24 مم × 60 مم.

< p class = "jove_content" fo: keep-togethe...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات C. ايليجانس النمو والزراعة والتركيب الإشريكية القولونية سلالة بكتيرية ، OP50 مركز التهاب كينورهابديت الوراثي 50 ر.ب طعام ل C. ايليجانس. يوراسيل أوكسوتروف. الإشريكية القولونية ب. السلامة البيولوجية المستوى 1 HSN GCaMP5 + mسلالة دودة الكرز مركز التهاب كينورهابديت الوراثي LX2004 جينات معدلة وراثية متكاملة باستخدام محفز nlp-3 لدفع تعبير GCaMP5 و mCherry في HSN. النمط الجيني الكامل:
vsIs183 [nlp-3p :: GCaMP5 :: nlp-3 3'UTR + nlp-3p :: mCherry :: nlp-3 3'UTR + lin-15 (+)] ، lite-1 (ce314) ، lin-15 (n765ts) X Lite-1 (CE314) ، Lin-15 (N765TS) سلالة متحولة لإعداد الجينات المعدلة وراثيا كاتب LX1832 سلالة لاستعادة الجينات المعدلة وراثيا عالية النسخ بعد الحقن المجهري باستخدام بلازميد الإنقاذ pL15EK lin-15 (n765ts). يحمل أيضا طفرة lite-1 (ce314) المرتبطة التي تقلل من حساسية الضوء الأزرق. متاح من المؤلف حسب الطلب pL15EK lin-15a / b بلازميد الإنقاذ الجيني كاتب pL15EK بلازميد الإنقاذ لاستعادة المعدلة وراثيا بعد الحقن في LX1832
Lite-1 (CE314) ، Lin-15 (N765TS) سلالة X. متاح من المؤلف حسب الطلب بلازميد pKMC299 كاتب بكالوريوس 299 البلازميد للتعبير عن mCherry في HSNs من محفز nlp-3. لديه nlp-3 3 'منطقة غير مترجمة بلازميد pKMC300 كاتب بكالوريوس 300 البلازميد للتعبير عن GCaMP5 في HSNs من محفز nlp-3. لديه nlp-3 3 'منطقة غير مترجمة فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة سيغما ص 8281 لتحضير لوحات NGM فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة سيغما ص 5655 لتحضير لوحات NGM كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدرات أمريسكو 662 ريال لتحضير لوحات NGM ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم ألفا إيسار 12312 [م] لتحضير لوحات NGM الببتون بيكتون ديكنسون هاتف: 211820 لتحضير لوحات NGM كلوريد الصوديوم أمريسكو 241 ح. لتحضير لوحات NGM كولسترول ألفا إيسار أ11470 لتحضير لوحات NGM أجار ، بكتريولوجي من النوع أ ، فائق النقاء أفيميتريكس هاتف 10906 لتحضير لوحات NGM أطباق بتري 60 مم VWR هاتف: 25384-164 لتحضير لوحات NGM نظارات غطاء صغيرة مقاس 24 × 60 مم ، # 1.5 VWR 48393-251 غطاء زجاجي يتم من خلاله تصوير الديدان نظارات ذات غطاء صغير مقاس 22 × 22 مم ، # 1 VWR هاتف: 48366-067 غطاء زجاجي يغطي الجزء العلوي من قطعة أجار مجهر مجسم مع قاعدة ضوئية مرسلة لايكا م 50 تشريح المجهر لصيانة سلالة الدودة والتدريج والتركيب سلك إيريديوم بلاتيني ، (80:20) ، 0.2 مم ألفا إيسار AA39526-BW لنقل الدودة مجهر تصوير الكالسيوم طاولة هواء مضادة للاهتزاز TMC 63-544 طاولة مختبر Micro-g 30 × 48 بوصة مع 4 بوصات CleanTop M6 على سطح 25 مم مجهر مركب مقلوب زييس هاتف: 431007-9902-000 مجهر مقلوب Axio Observer.Z1 المنفذ الجانبي L80 / R100 (3 أوضاع) زييس هاتف: 425165-0000-000 لتحويل 20٪ من الإخراج إلى كاميرا المجال الساطع (CMOS)، و80٪ إلى الكاميرا الفلورية (sCMOS) حامل الإضاءة الخلفية القابل للإمالة زييس هاتف: 423920-0000-000 للتصوير بالأشعة تحت الحمراء / السلوك مصباح 12 فولت / 100 واط ث / جامع زييس هاتف: 423000-9901-000 للتصوير بالأشعة تحت الحمراء / السلوك مصباح هالوجين 12 فولت / 100 واط زييس 380059-1660-000 للأشعة تحت الحمراء / التصوير السلوكي. لا تنبعث مصابيح LED ذات الضوء الأبيض من ضوء الأشعة تحت الحمراء الكبيرة ، لذلك لن تسمح بتصوير المجال الساطع بعد مرشح ممر النطاق بالأشعة تحت الحمراء مرشح ممر النطاق بالأشعة تحت الحمراء مقاس 32 مم (750-790 نانومتر) لمصباح الهالوجين زييس هاتف: 447958-9000-000 ص.ب 750-790 ؛ DMR 32 مم ، للإضاءة بالأشعة تحت الحمراء للمجال الساطع والسلوك برج مكثف ذو 6 مرشحات (LD 0.55 H / DIC / Ph) ، بمحرك زييس هاتف: 424244-0000-000 للتصوير بالأشعة تحت الحمراء / السلوك المكثف والغالق زييس هاتف: 423921-0000-000 للتصوير بالأشعة تحت الحمراء / السلوك عدسة مجهر مع أنبوب ضوئي لكاميرا CMOS بالأشعة تحت الحمراء زييس هاتف: 425536-0000-000 للتصوير بالأشعة تحت الحمراء / السلوك العدسة 10x ، 23 مم زييس هاتف: 444036-9000-000 لتوطين الدودة على قطعة أجار محول C-Mount 2/3 "0.63x مزيل التكبير زييس هاتف: 426113-0000-000 جبل لكاميرا CMOS بالأشعة تحت الحمراء كاميرا CMOS للمجال الساطع بالأشعة تحت الحمراء والسلوك (مستشعر 1 بوصة) FLIR (أبحاث بوينت جراي سابقا) جي إس 3-ي3-41C6نيير-ج كاميرا لتصوير المجال الساطع بطاقة وحدة تحكم مضيف USB 3.0 FLIR (أبحاث بوينت جراي سابقا) ACC -01-1202 فريسكو FL1100 ، 4 منافذ 8 دبابيس ، كابل GPIO 1 متر ، موصل دائري Hirose HR25 FLIR (أبحاث بوينت جراي سابقا) ACC -01-3000 كابل لتشغيل TTL. يتصل السلك الأخضر ب GPIO3 / Pin 4 ويتصل السلك البني بالأرض / الدبوس 5 Plan-Apochromat 20x / 0.8 WD = 0.55 M27 زييس هاتف: 420650-9901-000 أفضل مزيج من التكبير والفتحة العددية ومسافة العمل برج عاكس 6 مكعبات ، بمحركات زييس هاتف: 424947-0000-000 للتصوير الفلوري قطار ضوء الفلورة ، بمحركات زييس هاتف: 423607-0000-000 للتصوير الفلوري مصراع مضان زييس هاتف: 423625-0000-000 للتصوير الفلوري مكعب مرشح الإثارة والانبعاث المزدوج GFP و mCherry (للمجهر) زييس هاتف: 489062-9901-000 طقم مرشح FL 62 HE BFP + GFP + HcRed للتصوير الفلوري نظام إضاءة LED زييس هاتف: 423052-9501-000 نظام Colibri.2 LED القابل للتشغيل لإضاءة الفلورسنت وحدة GFP LED (470 نانومتر) زييس هاتف: 423052-9052-000 Colibri.2 LED لإثارة مضان GFP وحدة mCherry LED (590 نانومتر) زييس هاتف: 423052-9082-000 Colibri.2 LED لإثارة مضان mCherry منزلق إيقاف القزحية لمعدات الضوء الساقط زييس 000000-1062-360 قزحية فتحة العدسة الميدانية للحد من إضاءة LED في مجال رؤية الكاميرا محول C-Mount 1 "1.0x زييس هاتف: 426114-0000-000 محول لتقسيم الصور وكاميرا sCMOS الفلورية مقسم الصور هاماماتسو أ12801-01 يمكن استخدام مقسمات الصور الأخرى Gemini W-View ، ولكن قد لا يتم تحسينها لحجم المستشعر الكبير لكاميرات sCMOS مرآة GFP / mCherry ثنائية اللون (مقسم الصور) سيمروك ديك02-R594-25x36 فصل GCaMP5 من mCherry وإشارات الأشعة تحت الحمراء مرشح انبعاث GFP (مقسم الصور) سيمروك FF01-525 / 30-25 التقاط مضان GCaMP5 mCherry/ مرشح الانبعاث (مقسم الصور) سيمروك FF01-647 / 57-25 هذا المرشح ضروري لاستبعاد ضوء الأشعة تحت الحمراء المستخدم في تصوير المجال الساطع كاميرا sCMOS للتألق (مستشعر 1 بوصة) هاماماتسو A12802-01 / C11440-22CU أوركا فلاش 4.0 V2. تسمح الموديلات الأحدث بإعدادات منفصلة للحصول على الصور على نصفين منفصلين من المستشعر ، مما يسمح بالحصول على صور ثنائية القناة مع مقسم الصور مرحلة XY الآلية Märzhäuser مسح IM 130 × 100 حركة المرحلة ؛ دقة XY لهذه المرحلة هي 0.2 ميكرومتر لكل خطوة وحدة تحكم XY Stage مع عصا التحكم لودل MAC6000 ، عصا التحكم XY التتبع اليدوي للديدان. يجب توصيل وحدة التحكم MAC6000 بالكمبيوتر الشخصي من خلال المنفذ التسلسلي (RS-232) الذي تم تكوينه إلى 115200 باود مجلس الاستحواذ الرقمي (DAQ) اردوينو اونو تلقي مشغلات TTL من كاميرا sCMOS. يجب تحميل Uno بحزمة Firmata القياسية ، ومنفذ USB للكمبيوتر الذي تم تكوينه إلى 57600 باود كابل BNC ذكر إلى BNC ذكر - 6 أقدام هوسا تكنولوجي هوب6 موصلات BNC لتشغيل TTL كابل متحد المحور BNC مطلي بالذهب إلى SMA ذكر (8.8 بوصة) أوكسيل 6.08642ه +11 لتوصيل مخرجات تشغيل الكاميرا الفلورية محول رأس الدوران BNC هانتك RRBNCTH21 محول قابس BNC إلى الموز (4 مم) BNC أنثى إلى أنثى موصل دياجنج 20130530009 محول BNC من أنثى إلى أنثى لتوصيل إخراج BNC من الكاميرا إلى قابس الموز أسلاك العبور المرنة بدون لحام Z& T GK1212827 لتوصيل مخرجات مشغل BNC ب Arduiono DAQ. ذكر إلى ذكر. محطة عمل عالية الأداء إتش بي Z820 نظام التشغيل Windows 7 ، ذاكرة وصول عشوائي (RAM) سعة 64 جيجابايت ، معالج Xeon مزدوج ، محرك أقراص C: مزود بذاكرة مصنوعة من مكونات صلبة ، منفذ تسلسلي (RS-232) ، فتحات PCIe3 متعددة للاتصال بشبكة إيثرنت ، بطاقات USB 3.0 ، ومحركات أقراص إضافية ذات حالة صلبة محرك الأقراص ذو الحالة الصلبة M.2 سامسونج ميجا-V5P512BW دفق وتحليل بيانات الصور عالية السرعة مهايئ محرك الأقراص ذو الحالة الصلبة M.2 لمحطات العمل ليكوم دي تي -120 محول M.2 إلى PCIe 3.0 رباعي المسارات التخزين المتصل بالشبكة سينولوجيا DS-2415+ تخزين بيانات التصوير وتحليلها محركات الأقراص الثابتة ويسترن ديجيتال WD80EFZX أحمر 8 تيرابايت ، 5400 دورة في الدقيقة من الفئة SATA 6 جيجابت / ثانية 128 ميجابايت ذاكرة تخزين مؤقت 3.5 بوصة. تخزين بيانات التصوير (10 محركات أقراص + 2 تكرار محرك أقراص) برمجيات اقتناء التألق هاماماتسو HCImage DIA تسجيل تسلسلات صور مضان لقناتين (GCaMP5 و mCherry) بمعدل 20 إطارا في الثانية الاستحواذ على برايتفيلد FLIR (أبحاث بوينت جراي سابقا) التقاط الذباب تسجيل تسلسلات صور JPEG الساطعة قارئ المنفذ التسلسلي للمرحلة بونساي https://bitbucket.org/horizongir/bonsai يسهل تتبع الديدان أثناء السلوك برنامج تحكم LED زييس اختبار صندوق الأدوات الجزئي 2011 لإعداد الكثافة وتشغيل المدخلات لمصابيح LED المختلفة في وحدة Colibri.2 إيمج جيه المؤسسه https://imagej.net/Fiji/Downloads مراجعة بسيطة لتسلسلات الصور وتغييرات التنسيق للاستيراد إلى برنامج Ratiometric Quantitation تفوق مايكروسوفت هاتف: 2002984-001-000001 لتوليد مجموعات فرعية من بيانات القيمة المفصولة بفواصل من Volocity لتحليل MATLAB اكتشاف الذروة متلاب R2017a البرنامج النصي المستخدم لحسابات ميزة ذروة النسبة القياس الكمي النسبي بيركين إلمر Volocity 6.3 يسهل حساب قنوات الصور النسبية, تجزئة الصورة للعثور على الكائن, وقياس نسبة الكائنات التي تم العثور عليها البرامج النصيه AnalyzeGCaMP_2017 متلاب متوسط النسبة والنص المركزي XY يحلل مخرجات القياس النسبي بتنسيق .csv ، ودمج الكائنات ومواضع النقطة الوسطى ، وحساب تغيرات النسبة (ΔR / R) ، وتحديد القمم وميزات الذروة ، وكتابة المخططات (مع وبدون قمم مشروحة) بتنسيق التذييل. لاستيراد ملف المصفوفة ، سيقوم البرنامج النصي بإخراج البيانات إلى ثلاثة مجلدات: تم تحليلها ، والقمم ، والتتبعات. الإخراج "المحلل" هو ملف مصفوفة للكائنات الموحدة بستة أعمدة (وحدات): الوقت (الزمان) ، والمساحة (ميكرون مربع) ، والنسبة ، والنقطة الوسطى X (ميكرون) ، والنقطة الوسطى Y (ميكرون) ، و ΔR / R. إخراج "القمم" هو ملف مصفوفة للنقاط الزمنية للقمم التي تم العثور عليها ، والسعة (في ΔR / R) ، وعرض الذروة (الصورة) ، وبروز الذروة. إخراج "الآثار" عبارة عن ملفات لاحقة لآثار الكالسيوم. XY-stage-final.bonsai بونساي قارئ المنفذ التسلسلي DAQ وموضع المرحلة الذي يتم تشغيله بواسطة TTL يسجل موضع المرحلة X و Y (بالميكرون) عندما يتلقى Arduino المرفق إشارة TTL إيجابية من كاميرا sCMOS أثناء التعرض للإطار. يكتب البرنامج النصي ملفا .csv يحتوي على أربعة أعمدة: رقم الإطار، وموضع X (ميكرون)، وموضع Y (ميكرون)، والوقت المنقضي بين الإطارات (عادة ~ 50 مللي ثانية عند التسجيل بمعدل 20 إطارا في الثانية). تتم إضافة موضع المرحلة X وY من هذا الإخراج (العمودان 2 و3 على التوالي) إلى مواضع النقطة الوسطى X وY من AnalyzeGCaM

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GCaMP5 mCherry

مقالات ذات صلة