تسجيل تذبذبات نطاق جاما من الخلايا العصبية لنواة الساقين في شريحة دماغية

الملخص

المصدر: Urbano ، F. J. ، et al. تسجيل تذبذبات نطاق جاما في الخلايا العصبية لنواة pedunculopontine. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح الفيديو طريقة تسجيل تذبذبات نطاق جاما في الخلايا العصبية PPN. باستخدام قسم الدماغ السهمي مع حاصرات المشبكية في aCSF ، فإنه يستخدم نبضات تيار موجبة عبر ماصة رقعة لفتح قنوات الكالسيوم ، مما يؤدي إلى نشاط عتبة فرعية حاسمة لليقظة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. تحضير السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي القياسي (aCSF)

1. تحضير محلول المخزون أ
   1. أضف 700 مل من الماء المقطر إلى دورق نظيف سعة 1 لتر قبل إضافة المواد الكيميائية.
   2. أثناء التقليب المستمر بحجم 500 مل ، أضف 136.75 جم من كلوريد الصوديوم ، و 6.99 جم من كلوريد الصوديوم ، و 2.89 جم من MgSO₄ ، و 2.83 جم من NaH₂PO₄.
   3. أضف المزيد من الماء المقطر للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 1 لتر. بعد التخفيف ، يكون التركيز النهائي لكل مركب 117 ملي كلوريد الصوديوم ، و 4.69 ملي كلوريد الصوديوم ، و 1.2 ملي مولار MgSO₄ ، و 1.18 ملي هيدروشميد_{الصوديوم 2}PO₄.
   4. يحفظ في الثلاجة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
2. تحضير محلول المخزون ب
   1. أضف 700 مل من الماء المقطر إلى دورق نظيف سعة 1 لتر قبل إضافة المواد الكيميائية.
   2. أثناء التقليب المستمر بحجم 500 مل ، أضف 41.45 جم من D-glucose و 41.84 جم من NaHCO₃.
   3. أضف المزيد من الماء المقطر للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 1 لتر. بعد التخفيف ، يكون التركيز النهائي لكل مركب 11.5 ملي مولار D-glucose و 24.9 ملي NaHCO₃.
   4. يحفظ في الثلاجة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
   5. قبل كل تجربة ، اخلطي 50 مل من المرق A مع 50 مل من المرق B واتركيه حتى 1 لتر مع الماء المقطر للحصول على محلول aCSF للتركيز النهائي واتركه عند RT مع تزويده بالأكسجين المستمر بالكربوجين (95٪ O₂ - 5٪ CO₂ مزيج) لمدة 30 دقيقة على الأقل.

< p class = "jove_title" >2. تحضير السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي السكروز (السكروز-aCSF)

1. تحضير محلول المخزون C
   1. أضف 700 مل من الماء المقطر إلى دورق نظيف سعة 1 لتر قبل إضافة المواد الكيميائية.
   2. مع التقليب المستمر 500 مل من الماء المقطر ، أضف 240 جم من السكروز ، و 6.55 جم من NaHCO₃ ، و 0.671 جم من KCl ، و 4.88 جم من MgCl₂ ، و 0.22 جم من CaCl_{2 ،} و 0.21 جم من حمض الأسكوربيك.
   3. أضف المزيد من الماء المقطر للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 1 لتر. بعد التخفيف ، يكون التركيز النهائي لكل مركب 701.1 ملي مولار من السكروز ، و 78 ملي مولار من NaHCO₃ ، و 9 ملي مولار من كلوريد الأهلكسيوم ، و 24 ملي مولار من كلوريد_{المغنيد 2} ، و 1.5 ملي مولار من حمض الأسكوربيك.
   4. احتفظ بمحلول المرق C عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
   5. قبل كل تجربة ، اخلطي 300 مل من 50 مل من المرق C مع 600 مل من الماء المقطر للحصول على محلول السكروز - aCSF بالتركيز النهائي. اتركيه في RT مع تزويده بالأكسجين المستمر بالكربوجين (95٪ O₂ - 5٪ مزيج CO₂) لمدة 30 دقيقة على الأقل.

< p class = "jove_title" >3. تحضير الشريحة

1. ضع دقابا نظيفا بمحلول 100 مل من السكروز - aCSF في الثلج أثناء تزويده بالأكسجين بالكربوجين وقم بتثبيت الرقم الهيدروجيني عند 7.4 باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني مع إضافة بضع قطرات من محلول هيدروكسيد الصوديوم 0.1 مولار (عندما يكون الرقم الهيدروجيني < 7.4) أو محلول 0.1 مولار حمض الهيدروكلوريك (عندما يكون الرقم الهيدروجيني > 7.4).
2. املأ حجرة التقطيع من الاهتزاز بالسكروز aCSF وقم بتزويدها بالأكسجين. قم بتشغيل نظام التبريد القائم على الجلسرين المقترن بحجرة التقطيع وانتظر 15 دقيقة للسماح له بالتبريد حتى 0-4 درجة مئوية.
3. تخدير صغار الفئران (الذين تتراوح أعمارهم بين 9 و 12 عاما من فئران Sprague-Dawley البالغة الحامل في الوقت المناسب) بالكيتامين (70 مجم / كجم ، IPP ؛ باستخدام < 50 ميكرولتر الحجم النهائي). عندما يكون الجرو هادئا ، تحقق جيدا من غائب منعكس قرصة الذيل.
4. قطع رأس الجراء.
   1. قص جلد الرأس طوليا من الأمام إلى الخلف باستخدام شفرة مشرط من الفولاذ الكربوني ، واسحب الجلد إلى الجانبين باستخدام الملقط. اقطع العظم الذي يغطي الدماغ ، وحرك المقص بشكل جانبي ، وقم بإزالته تماما لكشف الدماغ.
   2. بعد ذلك ، قم بإزالة الدماغ بسرعة باستخدام ملعقة (توضع في البداية تحت البصلة الشمية لدفعها برفق من المنقارية نحو أكثر المناطق الذيلية). ادفع الدماغ برفق إلى السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي بالسكروز المؤكسج المبرد بالثلج (السكروز-aCSF).
5. قم بعمل قطع طفيلي على نصف الكرة الأيمن (إزالة ما يقرب من ثلث نصف الكرة الأرضية) ، وقم بلصق الجانب المشذب من الدماغ على قرص معدني سيتم تثبيته مغناطيسيا في غرفة القطع في آلة التقطيع الاهتزازية لقطع الأقسام السهمية 400 ميكرومتر التي تحتوي على نواة الساقي (PPN). احتفظ بشرائح PPN في RT لمدة 45 دقيقة قبل تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة.

فئة

4. تسجيلات تذبذبات نطاق جاما في شرائح PPN

1. تحضير محلول داخل الخلايا من البوتاسيوم وغلوكونات (محلول High-K +)
   1. ضع في الثلج دورق نظيف مع 10 مل من الماء المقطر. أثناء التقليب المستمر ، أضف إلى: K + غلوكونات ، 90.68 مجم فوسفوكرياتين دي تريس ، 47.66 مجم هيبس ، 1.5 مجم EGTA ، 40.58 مجم 2⁺ -ATP ، و 4 مجم Na ⁺ _2-GTP.
   2. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3 باستخدام KOH (100 ملي مولار في الماء المقطر). أضف الماء المقطر للوصول إلى الحجم النهائي 20 مل. إذا لزم الأمر ، اضبط الأسمولية مع السكروز (100 ملي مولار في الماء المقطر) لتكون 280-290 ملي أسم. بعد التخفيف ، يكون التركيز النهائي لكل مركب 124 ملي مولار K + -gluconate ، و 10 ملي مولار فوسفوكرياتين دي تريس ، و 10 ملي مولار HEPES ، و 0.2 ملي مولار EGTA ، و 4 ملي مولار^{2 +} -ATP ، و 0.3 ملي مولار Na ⁺ _2-GTP.
   3. Aliquot المحاليل داخل الخلايا في أنابيب 1 مل وتجميد عند -20 درجة مئوية. استخدم كمية واحدة يوميا واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية أثناء التجارب.
2. تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة
   1. ضع الشرائح في حجرة الغمر وقم بتكليفها (1.5 مل / دقيقة) مع أكسجين (95٪ O₂ - 5٪ CO₂) يحتوي على مضادات المستقبلات التالية: مضاد مستقبلات NMDA الانتقائي 2-أمينو-5-حمض فوسفونوفاليريك (APV ، 40 ميكرومتر) ، مضاد مستقبلات الغلوتامات AMPA / Kainate التنافسي 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2،3-dione (CNQX ، 10μM) ، مضاد مستقبلات الجلايسين الإستركنين (STR ، 10 ميكرومتر) ، مضاد مستقبلات GABA_A المحدد جابازين (GBZ ، 10 ميكرومتر) ، ومانع قناة الصوديوم tetrodotoxin (TTX ، 3μM)
      املأ ماصات التصحيح المسجلة (المقاومة 2-7 MΩ؛ مصنوعة من الشعيرات الدموية الزجاجية الزجاجية السميكة ذات الجدار السميك العادية المتوفرة تجاريا بقطر خارجي 1.0 مم وقطر داخلي 0.6 مم) بمحلول عالي K + داخل الخلايا باستخدام حشوات الماصات المتوفرة تجاريا مع مرشح المحلول. أدخل الماصة في حامل مكبر الصوت. استخدم ضغطا إيجابيا صغيرا باستخدام حقنة سعة 1 مل متصلة بحامل الماصة باستخدام أنبوب سيليكون متصل بصمام ثلاثي الاتجاهات. قم بتوصيل الجزء الخلفي من حامل الماصة بمكبر صوت مشبك التصحيح.
   2. حرك ماصة التسجيل باستخدام مناور دقيق ميكانيكي بالقرب من نواة PPN باستخدام هدف 4X مدمج مع بصريات تباين التداخل التفاضلي القريب من الأشعة تحت الحمراء.
      ملاحظه: يمكن ملاحظة نواة PPN في شرائح ظهرية إلى السويقة المخيخية العلوية (SCP ؛ يمكن ملاحظتها كحزمة سميكة من المحاور). تم وضع ماصات التسجيل في PPN pars compacta ، والتي تقع مباشرة في النهاية الخلفية للسويقة.
   3. اجعل ماصة التسجيل ملامسة خلية عصبية PPN أثناء تصورها باستخدام عدسة غمر الماء 40X ، وقم بتطبيق الشفط السلبي بسرعة لتشكيل ختم مع الخلية.
   4. استخدم برنامج مانع التسرب بمشبك الجهد لمراقبة مقاومة الماصة أثناء الشفط السلبي باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة.
      1. عندما يزداد الشفط السلبي ببطء، وتصل قيم المقاومة التي تقرأها شاشة المشبك الرقعة عند طرف الماصة إلى 80-100 موالم، قم بتغيير إمكانات التثبيت بسرعة إلى -50 مللي فولت وتحرير الضغط السلبي. ابدأ باستمرار في تطبيق الشفط السلبي حتى يتم تمزق غشاء الخلايا العصبية والوصول الكهربائي في تكوين الخلية بأكملها.
      2. إذا كانت قيم مقاومة الوصول المقاسة بواسطة برنامج ختم مشبك الجهد هي 10 مومتر أو أعلى ، فاستمر في تطبيق الشفط السلبي بكميات أقل.
   5. تعويض السعة (أي العابرين البطيئين والسريعين الذين لوحظوا بعد تمزق غشاء الخلية) ومقاومة السلسلة في وضع مشبك الجهد. قم بتبديل وضع التسجيل إلى المشبك الحالي ، وقم بتعويض قيم الجسر بسرعة (على سبيل المثال ، حرك مقبض مكبر الصوت أو انقر فوق قائمة التعويض التلقائي باستخدام ماوس الكمبيوتر).
      1. مراقبة إمكانات غشاء الراحة للخلايا العصبية PPN التي يتم تسجيلها باستمرار باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة. إذا تحول إمكانات الغشاء المريح نحو قيم إزالة الاستقطاب أو فرط الاستقطاب ، فاستخدم كميات صغيرة من التيار المباشر (حتى 100 باسكال باسكال) للحفاظ على القيمة النهائية المثلى -50 مللي فولت.
         ملاحظه: احتفظ فقط بالخلايا العصبية PPN ذات إمكانات غشاء الراحة المستقرة (RMP) من -48 مللي فولت أو أكثر فرط الاستقطاب (أي RMP < -48 مللي فولت).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات سكروز سيجما ألدريتش الطراز S8501 C12H22O11 ، الوزن الجزيئي = 342.30 بيكربونات الصوديوم سيجما ألدريتش إس 6014 NaHCO3 ، الوزن الجزيئي = 84.01 كلوريد البوتاسيوم سيجما ألدريتش ص 3911 KCl ، الوزن الجزيئي = 74.55 كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدرات سيجما ألدريتش M9272 MgCl2 · 6H2O ، الوزن الجزيئي = 203.30 ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم سيجما ألدريتش سي 3881 CaCl2 · 2H2O ، الوزن الجزيئي = 147.02 د- (+) - جلوكوز سيجما ألدريتش جي 5767 C6H12O6 ، الوزن الجزيئي = 180.16 حمض الأسكوربيك سيجما ألدريتش أ 5960 C6H8O6 ، الوزن الجزيئي = 176.12 كلوريد الصوديوم أكروس أورجانكس 327300025 كلوريد الصوديوم ، الوزن الجزيئي = 58.44 غلوكونات البوتاسيوم سيجما ألدريتش جي 4500 C6H11KO7 ، الوزن الجزيئي = 234.25 ملح فوسفوكرياتين دي (تريس) سيجما ألدريتش ص 1937 C4H10N3O5P · 2C4H11NO3 ، الوزن الجزيئي = 453.38 هيبس سيجما ألدريتش إتش 3375 C8H18N2O4S ، الوزن الجزيئي = 238.30 EGTA سيجما ألدريتش E0396 [-CH2OCH2CH2N (CH2CO2H) 2]2 ، الوزن الجزيئي = 380.40 ملح المغنيسيوم الأدينوزين 5'-ثلاثي الفوسفات سيجما ألدريتش أ 9187 C10H16N5O13P3 · xMg2 + ، الوزن الجزيئي = 507.18 غوانوزين 5'-ثلاثي فوسفات ملح الصوديوم هيدرات سيجما ألدريتش G8877 C10H16N5O14P3 · xNa + ، الوزن الجزيئي = 523.18 سترات السموم الرباعية مختبرات ألومون تي -550 C11H17N3O8 ، الوزن الجزيئي = 319.27 DL-2-أمينو-5-حمض فوسفونوفاليريك سيجما ألدريتش أ 5282 C5H12NO5P ، الوزن الجزيئي = 197.13 CNQX هيدرات ملح ثنائي الصوديوم سيجما ألدريتش سي 239 C9H2N4Na2O4 · xH2O ، الوزن الجزيئي = 276.12 الاستركنين سيجما ألدريتش S0532 C21H22N2O2 ، الوزن الجزيئي = 334.41 ميكاميلامين هيدروكلوريد سيجما ألدريتش M9020 C11H21N · حمض الهيدروكلوريك ، الوزن الجزيئي = 203.75 جابازين (SR-95531) سيجما ألدريتش S106 C15H18BrN3O3 ، الوزن الجزيئي = 368.23 هيدروكلوريد الكيتامين مايلان هاتف: 67457-001-00 مجهر نيكون اكليبس E600FN معالج دقيق أدوات سوتر ROE-200 معالج دقيق أدوات سوتر MPC-200 مكبر الأجهزة الجزيئية متعدد المشبك 700B محول A / D الأجهزة الجزيئية ديجي داتا 1440 أ سخان وارنر إنسترومنتس تي سي -324 ب ضخ كول بارمر ماسترفلكس إل / إس 7519-20 خرطوشة المضخة كول بارمر ماسترفلكس 7519-85 مجتذب الماصة أدوات سوتر ف-97 كاميرا تصوير Q RET-200R-F-M-12-C الاهتزاز لايكا بيوأنظمة لايكا VT1200 S نظام التبريد أدوات الاهتزاز 900 ص معدات مجهر نيكون اكليبس E600FN مناور دقيق أدوات سوتر ROE-200 مناور دقيق أدوات سوتر MPC-200 مكبر الأجهزة الجزيئية متعدد المشبك 700B محول A / D الأجهزة الجزيئية ديجي داتا 1440 أ سخان وارنر إنسترومنتس تي سي -324 ب ضخ كول بارمر ماسترفلكس إل / إس 7519-20 خرطوشة المضخة كول بارمر ماسترفلكس 7519-85 مجتذب الماصة أدوات سوتر ف-97 كاميرا تصوير Q RET-200R-F-M-12-C