$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. صنع سماعات رأس بقطبين ثنائيي القطب (الشكل 1)
- قطع 3.5 سم من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ المطلية بالبولي تترافلورو إيثيلين غير القابل للصدأ.
- قم بإزالة حوالي 1 مم من طبقة العزل عن السلك من كلا الطرفين. لا تجريد الكثير من الأسلاك.
- ضع دبابيس على حامل الملزمة بحيث يكون الجزء السفلي من الدبوس الذي يحتوي على شق أطول متجها لأسفل.
- ضع التدفق على الأطراف المجردة من السلك وعلى قمم المسامير.
قم - بقصدير الجزء المجرد من السلك بلحام كاف لتغطيته.
- أضف كمية قليلة من اللحام إلى الجزء العلوي من الدبوس دون أن يفيض على الجانبين.
- ضع أحد طرفي الأطراف المجردة من السلك في الدبوس بعمق أكبر قدر ممكن أثناء ذوبان اللحام.
ملاحظه: يوجد ثقب جانبي حيث يمكن أن يخرج السلك - لا تدع السلك يخرج من الدبوس. يجب أن يظل كل الأسلاك المجردة داخل الدبوس.
- كرر الخطوات من 1.6 إلى 1.7 للدبوس الثاني ، والآن مع الأطراف الأخرى المجردة من السلك.
- دع المسامير تجلس لمدة 30 ثانية لتثبيتها ، ثم قم بإزالتها من حامل الملزمة ، ثم اسحبها للتأكد من أن الاتصال بين السلك والمسامير قوي وثابت.
- شطف المسامير بالماء البارد ، ثم جفف.
- تحقق من الموصلية بين السن 1 والدبوس 2 باستخدام مقياس أوم.
- اجمع المسامير الموجودة في نهايات السلك معا ؛ امسكها متوازية وقريبة. المشبك hemostat في وسط السلك. بعد ذلك ، قم بتدوير المرقئ ، بحيث يلتف السلك حول نفسه بإحكام إلى حد ما. قم بإزالة المرقئ.
- قم بتثبيت ملقط على السلك الملتوي 2 مم أسفل المسامير وثني السلك عند 90 درجة.
- ادفع نفس السلك مرة أخرى 90 درجة للخلف فوق الملقط مما يؤدي إلى إنشاء انحناء آخر 1 مم من الأول.
- اقطع السلك الملتوي بزاوية 45 درجة أسفل الانحناء عند 3.5 مم بمقص حاد صغير.
- قم بإعداد اثنين من هذه الأقطاب الكهربائية ثنائية القطب (مزدوجة الدبوس الملتوية) لكل سماعة رأس (اختياري ، والثاني هو النسخ الاحتياطي في حالة حدوث مشاكل كهربائية في الأولى).
- قم بإعداد قطب مرجعي واحد عن طريق قطع سلك به دبابيس ملحومة على كلا الطرفين إلى قسمين (الخطوات 1.1-1.17 ، الشكل 1 أ).
- قطع السلك عند 7 مم.
- ثني النهاية 1 مم أسفل الحافة.
- بعد ذلك ، قم بتغطية الطرف المنحني 1 مم من السلك بالملقط وقم بتدوير السلك بإحكام حول الملقط لإنشاء حلقة صغيرة (قطرها 1 مم).
- قم بثني الحلقة بشكل عمودي على الجزء المستقيم من السلك لجعل طرف السلك يشير إلى الخارج مرة أخرى.
- قم بتجميع القطبين ثنائيي القطب والقطب المرجعي الفردي في قاعدة القاعدة المكونة من ستة سنون بطريقة تكون فيها الأقطاب الكهربائية ثنائية القطب جنبا إلى جنب مع مسافة 6 مم بينهما ، وأن يتم وضع القطب المرجعي في الفتحة الخارجية الوسطى (الشكل 1 ب).
ملاحظه: الطريقة البديلة هي زرع الأقطاب الكهربائية ، وتثبيتها في مكانها ، ثم إدخال دبابيسها في قاعدة التمثال.
< p class = "jove_title" >
2. زرع القطب الكهربائي التجسيمي
- تعقيم جميع الأدوات الجراحية ومجموعة الأقطاب الكهربائية المكونة من ستة سنون عن طريق التعقيم قبل الجراحة. يجب الحفاظ على مجال جراحي معقم أثناء الجراحة ، ويجب استخدام قفازات جراحية معقمة. يوصى باستخدام الستائر المعقمة (على سبيل المثال ، اضغط على الختم) لتغطية باستثناء منطقة الجراحة.
- استخدم الفئران VGAT-Cre البالغة من العمر 8 أسابيع (التي تعبر عن Cre recombinase تحت سيطرة جين ناقل GABA الحويصلي [VGAT] ، متطابقة مع العمر ، ذكورا وإناثا) للعمليات الجراحية بعد 4 أسابيع من الفطام. سجل وزن قبل الجراحة للسماح بقياس فقدان الوزن بعد الجراحة.
- استخدم مبخر الأيزوفلوران المعتمد أو نظام تخدير منخفض التدفق مزود بمضخة حقنة دقيقة ومبخر رقمي متكامل ووسادة حرارة التغذية المرتدة.
ملاحظه: أنظمة التدفق المنخفض قادرة على توصيل التخدير بمعدلات تدفق منخفضة تتناسب مع حجم إما في غرفة الحث أو من خلال مخروط الأنف على الإطار التجسيمي (70 مل / دقيقة ، تركيز الأيزوفلوران في الهواء 4٪ للحث و 2٪ للجراحة). لا يفيد استخدام تخدير أقل أثناء العمليات الجراحية فحسب ، بل يقلل أيضا من خطر تعرض موظفي المختبر للأيزوفلوران.
- ضع المخدر على وسادة ساخنة دافئة إلى 37 درجة مئوية لإبقائه دافئا أثناء الجراحة. إذا كنت تستخدم نظام درجة حرارة يتم التحكم فيه عن طريق التغذية المرتدة ، فأدخل مسبار درجة الحرارة المشحم قليلا في مستقيم لمراقبة درجة الحرارة أثناء الجراحة.
- قم بتركيب على الإطار التجسيمي عن طريق وضع قضبان الأذن برفق في الأذنين والأسنان العلوية الأمامية في شريط القاطع. ضع مخروط الأنف فوق الأنف لتوصيل التخدير المناسب. تأكد من أن الرأس مستوي ومتمركز ولا يمكن تحريكه عند فحصه قليلا.
- حقن تحت الجلد 0.5 مل من نورموسول للترطيب.
- ضع زيوت تشحيم العين لمنع جفاف القرنية.
- راقب عمق التخدير من خلال غياب منعكس الانسحاب بعد الضغط على إصبع القدم الخلفي ، ثم قلل الأيزوفلوران إلى 1.5٪ -2.0٪ أثناء الجراحة.
- قم بإزالة الشعر في المنطقة الجراحية وحولها عن طريق نتف أو استخدام المقص (الحلاقة) أو كريم إزالة الشعر وتطهير الجلد بثلاث دورات من التطبيق بالتناوب لليود والإيثانول ، مع الانتهاء من اليود. يوصى بإزالة الشعر بعيدا عن موقع الجراحة فقط إذا كانت هناك وسائل للحفاظ على التخدير في هذا الموقع. إذا لزم الأمر ، استخدم أدوات تطبيق ذات أطراف قطنية مغموسة بالكحول لإزالة الشعر من المنطقة المحيطة بالرأس. حقن 0.05 مل من بوبيفاكائين المسكن الموضعي (0.25٪) تحت الجلد.
- قم بعمل شق في الجمجمة باستخدام مشرط ، ثم اقطع جزءا من الجلد بمقص جراحي حاد ، وكشف الجمجمة. دفع الجلد جانبا ، باستخدام قطعة قطن ، قم بتنظيف الجمجمة من جميع العضلات والأنسجة الأساسية التي تعيق الرؤية.
ملاحظه: لوقف النزيف العرضي ، اضغط على موقع النزيف بقطعة قطن معقمة حتى يتوقف.
- نظف الجمجمة ببيروكسيد الهيدروجين باستخدام مسحات قطنية معقمة لجعل خيوط الجمجمة وكل من بريجما ولامدا مرئية.
- جفف الجمجمة جيدا ، ثم ضع قطرة واحدة من لاصق الأسنان ذاتي النقش باستخدام قضيبه. قم بتنظيفها بالفرشاة في الجمجمة ، وانتظر 60 ثانية ، وعالجها بضوء الأشعة فوق البنفسجية للأسنان لمدة 40 ثانية. يشير السطح اللامع إلى أن المادة اللاصقة قد تم ربطها بشكل فعال بالجمجمة.
ملاحظه: هذه الخطوة ضرورية للتثبيت الآمن لسماعة الرأس.
- استخدم مثقاب 0.031 بوصة (0.79 مم) لحفر فتحتين لشفرات ثنائيا لزرع أقطاب عمق الحصين (حوالي 5,000 دورة في الدقيقة). قم بحفر ثقب لدغ إضافي للقطب المرجعي فوق المخيخ خلف lambda.
ملاحظة: عند الحفر ، احرص على خفض المثقاب ببطء وتجنب الحفر في الدماغ.
- إحداثيات الأقطاب الكهربائية هي كما يلي (من بريجما بالمليمتر): أقطاب الحصين عند 3 مم خلفي ، 3 مم جانبي ، و 3 مم عمق ؛ والقطب المرجعي المخيخي عند 6 مم خلفي ، و 0 مم جانبي ، و 0 مم (تحت الجافية).
- لزيادة الدقة ، استخدم مثقابا مثبتا بشكل مجسم ، وقم بتصفير المحور X / Y للمناور التجسيمي عند لمس بريجما - هذه هي النقطة المرجعية للإحداثيات.
- قم بتجميع سماعة رأس عن طريق إدخال جميع الأقطاب الكهربائية في قاعدة التمثال ذات الستة سنون ، مع التأكد من دفع المسامير بالكامل إلى قاعدة التمثال. قم بتركيب قاعدة التمثال في حامل القطب الكهربائي على إطار تجسيمي (الشكل 1 ب).
- قم بمحاذاة الأقطاب الكهربائية فوق فتحات الأزيز المقابلة. قم بزرع أقطاب كهربائية من الأسلاك المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ ثنائية القطب الملتوية في الحصين الأيمن والأيسر والقطب المرجعي في المخيخ عن طريق خفض سماعة الرأس ببطء وتوجيه الأقطاب الكهربائية إلى فتحات النتوءات.
- عندما يكون القطب الملتوي للحصين فوق الفتحة مباشرة ، قم بصفر المحور Z وانخفض ببطء إلى -3.0 مم.
- قم بتغطية سطح الجمجمة والأقطاب الكهربائية بأسمنت الأسنان واملأ الفراغ بين سطح الجمجمة وأسفل قاعدة التمثال. ستكون حواف الجلد مجاورة لأسمنت الأسنان بحيث لا تبقى أي أنسجة أساسية مكشوفة. انتظر حتى يجف الأسمنت ويتصلب. ثم افصل حامل القطب الكهربائي عن الذراع التجسيمي وقم بإزالة الحامل من قاعدة التمثال.
- حقن 0.1 مل من الكيتوبروفين (1 ملغم / مل ، تحت الجلد [SC]) للتسكين وجرعة ثانية من 0.5 مل من نورموسول (SC) للترطيب وإزالة من الإطار التجسيمي.
- ضع وسادة متساوية الحرارة مسخنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية داخل قفص فارغ مغطى بمنشفة ورقية. بمجرد أن يستيقظ تماما ، ضع في قفص نظيف مع الفراش والطعام الطري ، وأعده إلى الحيدة. يتم إيواء منفردة من هذه النقطة فصاعدا لمنع مضغ سماعات الرأس لبعضها البعض. لا يتم استخدام قواديس القضبان السلكية لتجنب تعطل سماعات الرأس ، وبدلا من ذلك ، يتم ربط زجاجات المياه بالجانب السفلي من قمم القفص ، ويوجد طعام في الفراش.
- أطعم بعض الطعام الطري لمدة 72 ساعة بعد الجراحة وراقب فقدان الوزن ودرجة حالة الجسم. يمكن إعطاء المصابة بالجفاف 0.5 مل من نورموزول تحت الجلد إذا كانت تعاني من الجفاف (فقدان الوزن ، وزيادة تورم الجلد ، والعيون الغائرة). يمكن إعطاء كيتوبروفين تحت الجلد مرة واحدة يوميا لمدة يومين آخرين بعد الجراحة (اتبع نظام التسكين وفقا لإرشادات لجنة رعاية واستخدام المؤسسية المحلية [IACUC]). اسمح للحيوانات بالتعافي تماما في أقفاصها لمدة 4-7 أيام قبل نقلها إلى نظام تسجيل تخطيط كهربية الدماغ (EEG).
