تأثير التحفيز المباشر للتيار على نوبات الصرع المستحثة في شرائح دماغ الفئران

الملخص

المصدر: Lu ، H. ، et al. التحفيز المباشر وتسجيل المصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية للنشاط الشبيه بالنوبات في تحضير شريحة دماغ الفئران. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح الفيديو دراسة لتقييم تأثير التحفيز المباشر للتيار (DCS) على نوبات الصرع في شرائح دماغ الفئران. يتم وضع شرائح الدماغ التي تحتوي على مناطق المهاد الإنسي المتصلة (MT) والقشرة الحزامية الأمامية (ACC) في مصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية (MEA). يتم تطبيق المحفزات الكهربائية ل MT والأدوية المحفزة للنوبات للحث على نوبات الصرع في ACC. ثم يتم تطبيق DCS لتقييم تأثيره على النوبات المستحثة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

1. إعداد الحلول التجريبية والمعدات لتسجيل مصفوفة متعددة الأقطاب

الكهربائية

1. تحضير السائل النخاعي الدماغي الاصطناعي (السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي [aCSF] ؛ 124 ملي كلوريد الصوديوم ، 4.4 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي هيدروهيدرات_{هيدروكسيد الصوديوم 2}PO₃ ، 2 ملي ملي MgSO₄ ، 2 ملي كالسيكل₂ ، 25 ملي مولار NaHCO₃ ، و 10 ملي مولار جلوكوز ، فقاعات مع 95٪ O₂ و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}).
2. استخدم نوعين من مجسات MEA: 6 × 10 MEA مستو و 8 × 8 MEA. يغطي المسبار السابق المنطقة التي تتكون من القشرة والمخطط والمهاد. يغطي المسبار الأخير المنطقة القشرية فقط.
3. استخدم مكبر صوت 60 قناة مع مرشح تمرير النطاق الذي تم ضبطه بين 0.1 هرتز و 3 كيلو هرتز عند تضخيم 1,200. الحصول على البيانات بمعدل أخذ عينات 10 كيلو هرتز.
4. ضع سلكين فضيين مطليين ب AgCl داخل غرفة MEA ل DCS. استخدم الأسلاك الفضية المطلية ب AgCl لإنتاج مجالات كهربائية يتم إنشاؤها بواسطة محفز معزول.
5. ضع قطب التنغستن (القطر ، 127 ميكرومتر ؛ الطول ، 7.62 سم ؛ طرف مدبب 8 درجات AC ؛ المقاومة ، 5 MΩ) للتحفيز المهدي ، وضع القطب المرجعي في غرفة MEA. قم بتوصيل تيارات قطب التنغستن باستخدام محفز معزول يتم التحكم فيه بواسطة مولد النبض.

< ص الفئة = "jove_title" >2. تحضير شريحة الدماغ

1. استخدم ذكور الفئران C57BL / 6J ، بعمر 4-8 أسابيع. إيواء في غرفة مكيفة (21-23 درجة مئوية ؛ رطوبة 50٪ ؛ دورة إضاءة / مظلمة 12 ساعة / 12 ساعة ، أضواء مضاءة في الساعة 8:00 صباحا) مع إمكانية الوصول المجاني إلى الطعام والماء.
2. خذ 250 مل من aCSF الذي تم تحضيره في الخطوة 1.1 وضعه في دورق يحتوي على ثلج. في الوقت نفسه ، قم بتوفير الغاز المستمر الذي يتكون من 95٪ O₂ و 5٪ CO₂.
3. جراحة
   1. قم بتخدير بنسبة 4٪ من الأيزوفلوران في صندوق زجاجي لمدة 3 دقائق تقريبا. بمجرد أن يصل إلى عمق التخدير الجراحي (يشار إليه بعدم وجود استجابة لقرص إصبع القدم) ، ضعه على صينية ضحلة مملوءة بالثلج المجروش ، وقم بإزالة الرأس باستخدام المقص.
   2. كشف الجمجمة ، وتقليم العضلات المتبقية. بعد ذلك ، باستخدام rongeurs ، قم بإزالة السطح الظهري للجمجمة من الدماغ. قم بقص جوانب الجمجمة باستخدام rongeurs. تعقيم جميع الأدوات الجراحية بمحلول إيثانول بنسبة 75٪.
   3. باستخدام ملعقة ، قم بقطع البصيلات الشمية والوصلات العصبية على طول السطح البطني للدماغ ، وإزالة الدماغ. بعد قطع الرأس ، انقل الدماغ بسرعة إلى دورق مليء ب aCSF المؤكسج المثلج.
4. تحضير شريحة الدماغ MT-ACC
   ملاحظه: قم بإعداد الشرائح التي تحتوي على المسار من MT إلى ACC.
   1. قم بقص كتلة الدماغ يدويا بقطعتين سهمتين 2.0 مم جانبيا إلى خط الوسط في كل نصف كرة كرة لعرض التشريح تحت القشري. ثم قم بعمل قطعتين بزاوية. قم بعمل أول قطع متقاطع مواز للمسار الليفي المرئي في المخطط.
   2. قم بعمل التقاطع الثاني من الاتصال بين المخيخ والقشرة البصرية إلى نقطة المنتصف بين المسار الأمامي والقناة البصرية البطنية والموازية لمسار المهاد الحزامي.
   3. قم بتوصيل كتلة الدماغ بلوحة زاوية (~ 120 درجة) باستخدام مادة لاصقة cyanoacrylate وقم بعمل قطع فوق نقطة تحول المسار. افتح اللوحة ، وافردها ، وألصقها على مرحلة الغرفة من الاهتزاز.
   4. اصنع شرائح دماغ المهاد الإنسي ACC (بسمك 500 ميكرومتر) ثم اغمرها في aCSF المؤكسج المثلج. انقل الشرائح إلى غرفة التسجيل ، واحتفظ بها عند 32 درجة مئوية تحت التروية المستمرة (12 مل / دقيقة) مع aCSF المؤكسج لمدة 1 ساعة.

فئة

3. تحضير غرفة التروية لتسجيل مصفوفة متعددة الأقطاب

الكهربائية

1. تحضير غرفة التروية
   1. ضع مسبار MEA على نظام متعدد القنوات واستخدم أنبوبين منفصلين من البولي إيثيلين لتوصيل المسبار بمضخة تمعجية. استخدم أنبوبا واحدا لتوجيه aCSF إلى غرفة MEA والأنبوب الآخر لتوجيه aCSF خارج الغرفة. أخيرا ، قم ببث المستحضر باستمرار باستخدام aCSF المؤكسج الدافئ (29-30 درجة مئوية) (8 مل / دقيقة).
2. نقل شريحة الدماغ إلى الشرق الأوسط وأفريقيا. اضغط باستمرار على شريحة الدماغ في منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا باستخدام قطعة قطن مبللة. حرك شريحة الدماغ بعناية للتأكد من توجيه ACC فوق الأقطاب الكهربائية.
3. استخدم مجموعات الربط للشرائح والضغط على الضغط على شريحة الدماغ. تضمن هذه الخطوة اتصالا كهربائيا جيدا بين الشريحة والأقطاب الكهربائية.

فئة

4. توليد المجالات الكهربائية بواسطة DCS

ملاحظة: استند تعريف اتجاه المجال الكهربائي إلى اتجاه المحور المحوري في ACC. تم تأكيد اتجاهات مقصورات التغصنات والسوما باستخدام تلطيخ جولجي.

1. ضع قطب AgCl (المعرف على أنه الأنود) بالقرب من ACC وضع القطب الآخر (المعرف على أنه الكاثود) بعيدا عن ACC. سجل شدة المجال التي يتم إنشاؤها بواسطة اتجاهي المجال (متوازي وعمودي مع ألياف ACC المحورية) بواسطة MEA ، وقم بتوصيل تيارات المجالات الكهربائية باستخدام محفز.
2. قم بإصلاح مسافة أقطاب AgCl (حوالي 1.5-2 سم) واضبط القوة الحالية للمحفز لجعل DCS بين 0.5 و 2 مللي أمبير.

< p class = "jove_title" >5. الاستجابات المشبكية القشرية المستحثة كهربائيا

ملاحظة: إحداث استجابات متشابكة في ACC عن طريق التحفيز الكهربائي في MT ، حيث ينتج مولد التحفيز الكهربائي القابل للبرمجة نبضات تيار مستطيلة ثنائية الطور.

1. كرر القسم 3 أعلاه.
2. ضع قطب التنغستن في MT وقم بتوصيل النبضات من المحفز إلى منطقة المهاد للشرائح عبر أقطاب التنغستن ثنائية القطب.
3. استخدم شدة التيار المختلفة لتحديد العتبة التي تثير استجابة ACC. هنا ، استخدم شدة ±150 ميكرو أمبير ومدة 200 ميكرو ثانية ، مما أثار استجابة قصوى بنسبة 80٪ في ACC في معظم الشرائح.
4. حرك قطب التنغستن على طول مسار المهاد السنثري (من MT إلى الجسم الثفني) في شريحة MT-ACC للحصول على ملفات تعريف الاستجابة المثلى.
5. قم بإجراء 10-20 عملية مسح لاستجابات ACC واستخدم البرنامج لحساب متوسط كل ACC الذي يتم إثارته بواسطة تحفيز MT تلقائيا. والنتيجة هي الاستجابات المشبكية في ACC الناتجة عن تحفيز MT بواسطة مسار MT-ACC.

< p class = "jove_title" >6. نشاط يشبه النوبات المستحثة كهربائيا

< p class = "jove_content" >ملاحظة: تم إحداث نشاط يشبه النوبات عن طريق تطبيق 4-أمينوبيريدين (4-AP ؛ 250 ميكرومتر) وبيكوكولين (5 ميكرومتر). أظهرت دراسات التحكم في الوقت السابقة أن الاستجابات القصوى والمستقرة ظهرت بعد 2-3 ساعات من استخدام الدواء.

1. كرر القسم 5 أعلاه.
2. أضف الأدوية إلى محلول التروية. استخدم 4-AP (250 ميكرومتر) وثنائي الأبعاد (5 ميكرومتر). امزج الأدوية بشكل موحد ، واستمر في التروية لمدة 2-3 ساعات.
3. لتسهيل النشاط الشبيه بالنوبات ، حافظ على مضخة التروية بمعدل تروية سريع نسبيا (8 مل / دقيقة) ، مما قد يساعد أيضا في منع تراكم تدرج الأس الهيدروجيني.
4. ضع قطب التنغستن في MT ، وقم بتوصيل التحفيز الكهربائي (150 μA ، مدة 200 ميكرو ثانية) للحصول على ملفات تعريف استجابة ACC.
5. قم بإجراء 10-20 عملية مسح ومتوسط الردود.
6. استبدل محلول التروية ب aCSF الطازج لغسل الأدوية. كرر الخطوة 6.5.

7. اختبار تأثير DCS على الاستجابات القشرية المستحثة

1. كرر القسمين 3 و 4. تأكد من إنشاء مجالات كهربائية موحدة عن طريق تمرير التيارات بين سلكين فضيين متوازيين مطليين ب AgCl يتم وضعهما داخل غرفة MEA. إذا لم تكن هناك مشكلات، يظل DCS بين 0.5 و2 مللي أمبير.
2. قم بإيقاف تشغيل DCS وضع قطب التنغستن لتحفيز المهاد (±150 ميكرو أمبير ، مدة 200 ميكرو ثانية). للحصول على أقصى استجابات متشابكة في ACC ، قم بإجراء 10-20 عملية مسح ومتوسط الاستجابات.
قم
3. بتشغيل DCS (قوة 2 مللي فولت / مم DCS) والتحفيز المهادي (350 ميكرو أمبير ، مدة 200 ميكرو ثانية). تقييم التغيرات في سعة استجابة ACC التي يثيرها التحفيز المهادي أثناء DCS.
4. قم بإيقاف تشغيل DCS وأضف 4-AP (250 ميكرومتر) وبيكوكولين (5 ميكرومتر) إلى محلول التروية. ثم انتظر 2-3 ساعات. عندما تؤثر الأدوية على شريحة الدماغ ، تنتج الشريحة استجابات نوبات قشرية.
5. قم بإجراء 10-20 عملية مسح لاستجابات ACC ، ثم قم بقياس سعة ومدة استجابات النوبات القشرية الكهربائية.
6. بعد الخطوة 7.5 ، قم بتشغيل DCS (قوة 2 مللي فولت / مم DCS) والتحفيز المهادي (150 ميكرو أمبير ، 200 ميكرو ثانية). تقييم التغيرات في اتساع ومدة استجابات النوبات القشرية المستحثة أثناء تطبيق DCS.
7. استبدل محلول التروية ب aCSF الطازج لغسل الأدوية ، وكرر الخطوتين 7.2 و 7.3.
8. اجمع جميع بيانات التسجيل وقم بتجميع البيانات في ظروف تجريبية مختلفة. تقييم سعة ومدة استجابات النوبات القشرية في ظل ظروف تجريبية مختلفة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مخدر: إيزوفلوران شركة منتجات الهالوكربون NDC 12164-002-25 4٪ aCSF (الإجمالي: 1 لتر): د (+) - الجلوكوز ميرك 1.08337.1000 10 ملم كربونات هيدروجين الصوديوم ميرك 1.06329.0500 25 ملم كلوريد الصوديوم ميرك 1.06404.1000 124 ملم (+) - الصوديوم L-ascorbate ، > = 98٪ سيغما أ 4034-100 جرام 0.15 جم / 2 متر مكعب كبريتات المغنيسيوم ، اللامائية ، ReagentPlus سيغما M7506-500G 2 مللي ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم ميرك 1.02382.1000 2 مللي أحادي هيدرات فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم ميرك 1.06346.1000 1 ملي متر كلوريد البوتاسيوم ماي آند بيكر المحدودة داجنهام إنجلترا MS 7616 4.4 ملي عقاقير: (+) -بيكوكولين توكريس 130 5 ميكرومتر في aCSF 4-أمينوبيريدين توكريس 940 250 ميكرومتر في aCSF تحضير شريحة الدماغ: الاهتزاز الاهتزاز سلسلة 1000 تقطيع الكتل إلى شرائح بسمك 500 ميكرومتر نظام الشرق الأوسط وأفريقيا: مجسات مصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية (MEA): 6 × 10 MEA مستوي أنظمة متعددة القنوات 60MEA500 / 30iR-Ti-pr MEAS 6x10 قطر القطب الكهربائي ، 30 ميكرومتر ؛ تباعد القطب الكهربائي ، 500 ميكرومتر ؛ مقاومة ، 50 كيلو أوم عند 200 هرتز مجسات مصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية (MEA): 8 × 8 MEA أياندا بيوسيستمز 60MEA200 / 10iR-Ti-pr MEAS 8x8 قطب كهرمي الشكل ؛ قطر ، 40 ميكرومتر ؛ ارتفاع الطرف ، 50 ميكرومتر ؛ تباعد القطب الكهربائي ، 200 ميكرومتر ؛ مقاومة ، 1,000 كيلو أوم عند 200 هرتز تم استخدام مكبر للصوت 60 قناة مع مرشح تمرير النطاق بين 0.1 هرتز و 3 كيلو هرتز عند تضخيم 1,200X أنظمة متعددة القنوات MEA-1060-BC برنامج MC Rack بمعدل أخذ عينات 10 كيلو هرتز أنظمة متعددة القنوات برنامج لجمع البيانات وتسجيلها التحكم في مولد النبض أنظمة متعددة القنوات STG 1002 مجموعات تثبيت الشرائح والضغط عليها وارنر إنسترومنتس SHD-26H / 10 ؛ WI64-0250 المضخة التمعجية-minipuls3 جيلسوم MINIPULS3 معدل التروية: 8 مل / دقيقة نظام التحفيز: محفز معزول أنظمة AM موديل 2100 شدة ±350 ميكرو أمبير ، مدة 200 ميكرو ثانية قطب التنغستن أنظمة AM 575300 وضعت في المهاد