استخراج البروتين من الخلايا العصبية

الملخص

المصدر: Shani, T., et al. فحص لقياس النقل النووي للكريات النووية في الوقت الفعلي داخل خلايا NSC-34 الشبيهة بالخلايا العصبية الحركية. J. Vis. Exp. (2017)

يحدد هذا البروتوكول استخراج البروتينات من الخلايا السرطانية العصبية. يتم غسل الخلايا بمخزن مؤقت وتحللها عن طريق الاضطراب الأنزيمي والميكانيكي. يتم جمع المادة الطافية الغنية بالبروتين المستخرجة بعد الطرد المركزي.

البروتوكول

1. إعداد خط الخلية

1. قم بإذابة ما يقرب من 1،000،000 من خلايا الحبل الشوكي للورم الأرومي العصبي للفأر (خلايا NSC-34) التي تم تخزينها في حاوية نيتروجين سائلة. استخدم حاضنة مياه 37 درجة مئوية حتى تذوب الخلايا تماما.
2. أضف متوسطا طازجا ودافئا (وسط DMEM يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 1٪ L-glutamine ، و 1٪ مضادات حيوية من القلم العقدي).
3. خلايا مذابة بأجهزة الطرد المركزي (SL16R) عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، لتشكيل حبيبات خلية. تخلص من الوسيط وأضف 1 مل من الوسط الجديد لإعادة تعليق الخلية.
4. ضع الخلايا المعلقة في قارورة سعة 15 مل وأضف 5 مل إضافية من المتوسط. احتضان الخلايا طوال الليل في حاضنة معقمة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية.
5. في موازاة ذلك ، ضع 8 أغطية غير مطلية (غطاء زجاجي: 12 مم ، سمك 0.13-0.17 مم) في طبق استزراع 60 مم وقم بتعقيمه باستخدام 70٪ من الإيثانول والتعرض لمدة 30 دقيقة من ضوء الأشعة فوق البنفسجية حتى يجف. أضف متوسطا إلى كل طبق وتخلص منه لغسل الإيثانول المتبقي.
6. أضف عازلة التربسين (2.5 جم من التربسين و 0.2 جم من EDTA في 1 لتر من محلول الملح المتوازن من هانكس) إلى الخلايا بعد أن تصل إلى ما يقرب من 90٪ من التقاء (حوالي 6 ملايين خلية لكل قارورة) للسماح للخلايا الملتصقة بالانفصال.
   ملاحظة: خلايا NSC-34 حساسة ولا تتطلب سوى 15 ثانية من حضانة التربسين العازلة ودقيقة إضافية واحدة من الحضانة الخالية من التربسين قبل التفكك باستخدام الوسط.
7. ضع الخلايا على أطباق الاستزراع مقاس 60 مم التي تحتوي بالفعل على أغطية مع 3 مل من الوسط ، أي حوالي 350.000 لكل طبق. اتركها في الحاضنة لمدة 24 ساعة للسماح بربط الخلية بالغطاء.

2. التحقق من صحة تعبير البروتين

1. ضع أطباق استزراع 60 مم تحتوي على الخلايا المتبقية (غير المستخدمة في التجربة أعلاه) من كل مجموعة تجريبية على الجليد.
2. تخلص من الوسيط واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS لتخفيف وغسل الوسط المتبقي.
3. عالج الخلايا ب 200-400 ميكرولتر من محلول التحلل الذي يحتوي على PBS و 0.5٪ تريتون وقرص كوكتيل مثبط للبروتياز (PI). كشط باستخدام مكشطة الخلية.
4. اجمع الخلايا في مخزن التحلل في أنبوب طرد مركزي دقيق وتجانس باستخدام الخالط عند 4,000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة تحت الجليد.
5. قم بالطرد المركزي للخلايا المتجانسة عند 2,500 × جم لمدة 10 دقائق. اجمع المادة الطافية ، وحدد تركيز البروتين باستخدام اختبار برادفورد ، وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
6. اجمع ما بين 30 و 70 ميكروغرام من إجمالي البروتين (حسب البروتين) وقم بتحميله في هلام SDS-PAGE لاختبار تعبير البروتين باستخدام مقايسة اللطخة المناعية.

المواد