عزل البروتينات السطحية وداخل الخلايا عن ثقافة الخلايا النجمية

الملخص

المصدر: ثام ، دي كيه إل ، وآخرون. تحديد التعبير عن سطح الخلية ومعدل الخلايا الداخلية للبروتينات في مزارع الخلايا النجمية الأولية باستخدام البيوتينيل. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو عزل سطح الخلية والبروتينات داخل الخلايا عن ثقافة الخلايا النجمية. يتم وضع ثقافة الخلايا النجمية على الجليد لتثبيط الالتقام الخلوي ، ثم يتم تصنيف بروتينات سطح الخلية بكاشف البيوتينيل. يتم تحلل الخلايا لإطلاق بروتينات سطح الخلية الحيوية والبروتينات داخل الخلايا غير الحيوية. أخيرا ، يتم استخدام الخرز المطلي بالستربتافيدين لفصل بروتينات سطح الخلية الحيوية عن البروتينات داخل الخلايا.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحديد التعبير النسبي لبروتين سطح الخلية في الخلايا النجمية عن طريق البيوتينيل

ملاحظة: هنا ، نوضح تطبيق تقنية البيوتينيل هذه لدراسة تأثيرات جزيء المصفوفة خارج الخلية اللامينين على توطين سطح الخلية للقناة المنفذة للماء aquaporin-4 (AQP4). تشمل المواد المتخصصة المطلوبة لهذا الاختبار سلفو-NHS-LC-البيوتين (سلفوسوكسينميديل 6- (بيوتيناميدو) هيكسانوات) وراتنج الستربتافيدين-أغاروز (انظر جدول المواد).

1. باستخدام الطريقة ، قم بإعداد ثقافات الخلايا النجمية القشرية قبل أسبوعين تقريبا من الفحص ، وزراعتها في قوارير ثقافة 75 سم². عندما تكون الخلايا النجمية 80-90٪ ملتقية ، افصلها عن سطح المزرعة باستخدام 0.05٪ تربسين ، ثم قم بتمريرها 1: 3.
2. في 48 ساعة قبل الفحص ، عندما تكون الخلايا مرة أخرى 80-90٪ ملتقية ، تمر الخلايا النجمية 1: 3 (مع الأخذ في الاعتبار التغيير في تنسيق الثقافة) على أطباق زراعة الخلايا 60 مم بحيث تكون ملتقى بنسبة >70٪ في اليوم الذي ستجري فيه التجربة. تأكد من توزيع الخلايا بالتساوي بين الأطباق.
3. في 16 ساعة قبل الفحص، توضع الماصة في وسط الاستزراع إلى تركيز نهائي قدره 24 نانومتر، وتحتضن عند 37 درجة مئوية.
4. قبل الفحص مباشرة ، قم بإعداد ما يلي ، ثم ضعه على الثلج أو ضعه في الثلاجة: CM-PBS (100 مجم / لتر MgCl₂∙6H₂O و 100 مجم / لتر CaCl₂ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X [PBS] ، درجة الحموضة 7.4) ، مخزن البيوتين (0.5 مجم / مل سلفو-NHS-LC-biotin في CM-PBS) ، مخزن التبريد (50 ملي مولار NH₄Cl في CM-PBS) ، عازل التحلل (25 ملي تریس ، درجة الحموضة 7.4 ، 25 ملي مولار جلايسين ، 150 ملي كلوريد الصوديوم و 5 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك [EDTA] ، 1٪ تريتون X-100 ، كوكتيل مثبط للبروتياز 1X) ، مخزن مؤقت للتحميل 3X (150 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 6.8 ، 6٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم [SDS] ، 30٪ جلسرين ، 300 ملي مولار ديثيوثريتول [DTT] و 0.01٪ بروموفينول أزرق) ، ومخزن الغسيل (10 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، 1.5 ملي EDTA ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1٪ تريتون X-100 ، كوكتيل مثبط للبروتياز 1X).
5. قم بإزالة الأطباق التي تحتوي على مزارع الخلايا النجمية من الحاضنة وتخلص من الوسيط.
6. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 4 مل CM-PBS المبرد وضع الأطباق على الثلج المجروش.
7. ماصة سعة 2 مل من البيوتين في كل بئر ، وقم بإمالة الأطباق برفق ذهابا وإيابا عدة مرات لضمان التغطية الكاملة. اتركيه على الثلج لمدة 30 دقيقة.
8. قم بإزالة مخزن البيوتين المؤقت باستخدام شفاط واستبدله بمخزن تبريد سعة 4 مل. اتركيه على الثلج لمدة 10 دقائق.
9. استنشق المخزن المؤقت للتبريد واستبدله بحجم مكافئ من نفس الحجم. مرة أخرى ، اتركيه على الجليد لمدة 10 دقائق.
10. تخلص من مخزن التبريد ، واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 4 مل CM-PBS المبرد.
11. اكشط الخلايا إلى 1 مل CM-PBS المبرد باستخدام رافع الخلايا وانقل التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
12. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 100 × جم لمدة 3 دقائق.
13. اترك العينات على الجليد لمدة 30 دقيقة ، مع الدوامة كل 5 دقائق ، أو ضعها على دوار من طرف إلى طرف عند 4 درجات مئوية.
14. قم بالطرد المركزي للمحللة عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات أي مواد غير قابلة للذوبان في المنظفات. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
    1. وفر 50 ميكرولتر من هذا المحلل وأضف مخزن التحميل إليه. ثم قم بتغيير طبيعته عن طريق التسخين عند 95 درجة مئوية في حمام جاف ؛ هذا هو جزء "الإدخال" ، الذي يحتوي على كل من بروتينات سطح الخلية الحيوية ، بالإضافة إلى البروتينات العصارية الخلوية غير الحيوية.
15. قم بتوسيع فتحة طرف الماصة عن طريق قطع ما يقرب من 0.5 سم من المادة من نهايته باستخدام مقص حاد. باستخدام طرف الماصة هذا، انقل 75 ميكرولتر من حبيبات الستربتافيدين-أغاروز (المخزنة عادة عند 4 درجات مئوية) إلى المحللة، واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات على شاكر/هزاز.
    1. نظرا لأن الستربتافيدين أغاروز يباع بشكل متكرر كملاط يحتوي على 50٪ من الخرز من حيث الحجم ، معلق في محلول مضاد للميكروبات ، قم بترتيبات الملاط لضمان تعليق الخرزات بالتساوي ، ثم ماصة 150 ميكرولتر من التعليق في كل عينة.
16. حبات بيليه ستربتافيدين أغاروز عن طريق الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية.
17. وفر 50 ميكرولتر من المادة الطافية (أضف عازلة التحميل وقم بتشويطيها عند 95 درجة مئوية في حمام مائي أو كتلة تسخين) ؛ وهذا يمثل الجزء "داخل الخلية" ويتكون بشكل أساسي من بروتينات العصارة الخلوية غير البيوتينية.
18. أعد تعليق الخرزات المحببة في مخزن مؤقت للغسيل سعة 1 مل ، وهزها لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. حبات الحبيبات (كما في الخطوة 1.16) وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه العملية 4x لتقليل الارتباط غير المحدد للبروتينات العصارية الخلوية غير الحيوية.
19. قم بتكبيل الخرزات بالطرد المركزي (1500 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية) وتخلص من مخزن الغسيل العلوي. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل 1X (مخفف باستخدام المخزن المؤقت للتحلل). إطلاق البيوتين والستربتافيدين من الخرز عن طريق تغيير طبيعة هذا عند 95 درجة مئوية ؛ يجب أن يحتوي هذا الجزء على بروتينات سطح الخلية الحيوية فقط (جزء "سطح الخلية").
    1. افصل المدخلات وسطح الخلية والكسور داخل الخلايا بواسطة SDS-PAGE (الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات الصوديوم) ، وقم بتحليله عن طريق النشاف الغربي.
       ملاحظه: بينما استخدمنا هلام متدرج مسبقة الصب بنسبة 4-20٪ في تجاربنا ، يجب أن يكون الجل المنفصل بنسبة 12-14٪ مع طبقة تكديس بنسبة 4٪ (يحتوي كل منها على 0.1٪ SDS) كافيا للبروتينات ذات الأهمية في هذه الدراسة. يجب أيضا استخدام معيار الوزن الجزيئي لنطاق الحجم المناسب. لاحظ أنه يمكن أن يكون هناك في بعض الأحيان تحول صعودي يمكن ملاحظته في الكتل الجزيئية الظاهرة للبروتينات الحيوية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كلوريد الأمونيوم (NH₄Cl) فيشر ساينتيك أ 661-500 بروموفينول الأزرق بيو راد #1610404 كوكتيل كامل مثبط البروتياز سيجما ألدريتش 11697498001 ثنائي الصوديوم إيثيلين ديامين تترا أسيتات ثنائي هيدرات (EDTA) بيو راد #1610729 ديثيوثريتول (DTT) بيو راد #1610611 EZ-لينك سلفو-NHS-LC-بيوتين ثيرمو فيشر العلمي #21335 الجلسرين فيشر ساينتيك بي ت 229-1 جلايسين سيجما ألدريتش جي 8898 Laminin من Engelbreth-Holm-Swarm غشاء القاعدي لساركوما الفئران سيجما ألدريتش L2020 محلول ملحي عازل للفوسفات جيبكو / ثيرمو فيشر العلمي 10010-023 كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) فيشر ساينتيك S271-500 ذوبان الجليد. كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) سيجما ألدريتش 862010 هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) فيشر ساينتيك S318-100 راتنج ستربتافيدين أغاروز ثيرمو فيشر العلمي #20347 تريتون X-100 فيشر ساينتيك بي بي 151-500