تقييم استيعاب البروتينات السطحية المستهدفة باستخدام مشتق البيوتين

Abstract

< p class = "jove_content" >المصدر: Tham، D.K.L.، وآخرون ، تحديد التعبير عن سطح الخلية ومعدل الخلايا الداخلية للبروتينات في مزارع الخلايا النجمية الأولية باستخدام البيوتينيل. J. Vis. إكسب. (2017).

يوضح هذا الفيديو طريقة لتقييم استيعاب البروتين المستهدف في الخلايا النجمية القشرية للفأر باستخدام البيوتينيل ، متبوعا بتحلل الخلية ، واستخراج البروتين القائم على الستربتافيدين ، والتمسخ ، وتحليل اللطخة الغربية لتأكيد الاستيعاب الناجح.

Protocol

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< p class = "jove_title" >1. تحديد معدل استيعاب بروتينات سطح الخلية في الخلايا النجمية عن طريق البيوتينيل

ملاحظة: في ما يلي ، نصف تجربة بيوتينيل نموذجية لمطاردة النبض تستخدم في هذه الحالة لتتبع الالتقام الخلوي ل AQP4 في الخلايا النجمية. تشمل المواد المتخصصة المطلوبة السلفو-NHS-SS-البيوتين ، وراتنج الستربتافيدين - أغاروز ، والجلوتاثيون المختزل ، واليودوأسيتاميد (انظر جدول المواد).

1. قم بإعداد مزارع الخلايا النجمية القشرية للفأر في أطباق 60 مم باستخدام الطرق الموضحة في القسم السابق. تأكد من أن الخلايا تتلاقى حوالي 70٪ في يوم الفحص وأن كل طبق يحتوي على عدد مكافئ من الخلايا.
2. قبل الفحص مباشرة ، قم بإعداد ما يلي ، وضعه على الثلج أو ضعه في الثلاجة: CM-PBS أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات (100 مجم / لتر MgCl₂∙6H₂O و 100 مجم / لتر CaCl₂ في 1X PBS ، pH7.4) ، مخزن البيوتين (0.5 مجم / مل سلفو-NHS-SS-biotin في CM-PBS) ، مخفضة المخزن المؤقت (50 ملي مولار الجلوتاثيون المختزل ، 75 ملي كلوريد الصوديوم و 75 ملي هيدروكسيد الصوديوم) ، مخزن التبريد (50 ملي مولار يودوأسيتاميد ، 1٪ BSA ، في CM-PBS) ، عازلة التحلل (25 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 7.4 ، 25 ملي جلايسين ، 150 ملي كلوريد الصوديوم و 5 ملي مولار EDTA أو حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك ، 1٪ تريتون X-100 ، كوكتيل مثبط للبروتياز 1X) ، مخزن مؤقت للتحميل 3X (150 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 6.8 ، 6٪ SDS أو كبريتات دوديسيل الصوديوم ، 30٪ جلسرين ، 300 ملي مولار DTT أو ديثيوثريتول و 0.01٪ بروموفينول أزرق) ، ومخزن الغسيل (10 ملي تريس ، درجة الحموضة 7.4 ، 1.5 ملي EDTA ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1٪ تريتون X-100 ، كوكتيل مثبط للبروتياز 1X).
3. تحضير وسط زراعة الخلايا الطازجة (وسط النسر المعدل من Dulbecco؛ أو DMEM المكمل بمصل الأبقار الجنينية بنسبة 10٪، و1٪ بنسلين/ستربتومايسين، و1٪ ل-جلوتامين)، وضعه في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
4. قم بإزالة مزارع الخلايا النجمية من الحاضنة ، وشفط الوسط باستخدام شفاطة.
5. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 4 مل CM-PBS المبرد ، وضع الأطباق على الثلج المجروش.
6. تقوم الماصة بتخزين 3 مل من البيوتين في كل طبق ، وقم بإمالة الأطباق ذهابا وإيابا عدة مرات للتأكد من توزيع المخزن المؤقت جيدا ، واتركه على الجليد لمدة 30 دقيقة.
7. استنشق عازلة البيوتين ، واستبدله ب 5 مل وسط دافئ. احتضن طبق استزراع عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، وطبق ثان بنفس درجة الحرارة لمدة 30 دقيقة. اترك طبقا آخر عند 4 درجات مئوية مثل عينة 0 دقيقة.
8. في نهاية فترة الحضانة ، تخلص من الوسط واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 4 مل CM-PBS المبرد. ماصة 6 مل تقلل من المخزن المؤقت فوق الخلايا وتتركها على الجليد لمدة 15 دقيقة.
9. قم بإزالة المخزن المؤقت المختزل واستبدله ب 6 مل من المخزن المؤقت الطازج. ضع الخليط على الثلج لمدة 15 دقيقة إضافية.
10. قم بإزالة محلول الاختزال واستبدله بمخزن تبريد سعة 6 مل. اتركيه على الثلج لمدة 15 دقيقة.
11. كرر خطوة التبريد مرة أخرى.
12. تخلص من المخزن المؤقت للتبريد ، واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 4 مل من PBS المبرد.
13. باستخدام رافع الخلايا ، اكشط الخلايا إلى 1 مل PBS مبرد ونقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.
14. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 100 × جم لمدة 3 دقائق.
15. اتركي هذا على الجليد لمدة 30 دقيقة ودوامة كل 5 دقائق. بدلا من ذلك ، ضع العينات على دوار من طرف إلى طرف عند 4 درجات مئوية لهذه المدة.
16. قم بالطرد المركزي للمحللات عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات المواد غير القابلة للذوبان في المنظفات ، ثم نقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. وفر 50 ميكرولتر من هذا المحلل ، وأضف عازل التحميل إليه ، وقم بتغيير طبيعة الجسم عند 95 درجة مئوية في حمام جاف ؛ هذا هو جزء "الإدخال" ، الذي يحتوي على كل من البروتينات الخلوية الحيوية والبروتينات غير الحيوية.
17. باستخدام طرف ماصة مقطوع، أضف 150 ميكرولتر من ملاط الستربتافيدين-أغاروز إلى المحللة، واحتضنه عند 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات على شاكر/هزاز.
حبيبات بيليه
18. ستربتافيدين - أغاروز بالطرد المركزي عند 1,500 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية.
19. أعد تعليق الخرزات في 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل والصخور لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. حبات الحبيبات (حسب الخطوة 1.18) وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه العملية 4 مرات لتقليل الارتباط غير المحدد للبروتينات العصارية الخلوية غير الحيوية.
20. حبات الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 1,500 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية وتخلص من مخزن الغسيل العلوي. أضف 50 ميكرولتر 1X مخزن مؤقت للتحميل (مخفف باستخدام المخزن المؤقت للتحلل). إطلاق البيوتين والستربتافيدين من الخرز عن طريق تغيير الطبيعة عند 95 درجة مئوية ؛ يجب أن يحتوي هذا الجزء على بروتينات سطح الخلية الداخلية فقط (الجزء "الخلوي").
21. افصل المدخلات وسطح الخلية والكسور غير المنضمة بواسطة الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد كبريتات الصوديوم (SDS-PAGE) ، وتحليلها بواسطة النشاف الغربي.
    ملاحظه: بينما استخدمنا هلام متدرج مسبقة الصب بنسبة 4-20٪ في تجاربنا ، يجب أن يكون الجل المنفصل بنسبة 12-14٪ مع طبقة تكديس بنسبة 4٪ (يحتوي كل منها على 0.1٪ SDS) كافيا للبروتينات ذات الأهمية في هذه الدراسة. يجب أيضا استخدام معيار الوزن الجزيئي لنطاق الحجم المناسب. لاحظ أنه يمكن أن يكون هناك في بعض الأحيان تحول صعودي يمكن ملاحظته في الكتل الجزيئية الظاهرة للبروتينات الحيوية.

Materials