$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير المصفوفات
- قم بغلي 4-8 مصفوفات سيليكون في الميكروويف أو على طبق ساخن لمدة 5 دقائق واتركها تجف تماما لمدة 1 ساعة تحت التدفق الرقائقي (الجانب المخطط لأعلى).
ملاحظه: يجب تنفيذ الإجراءات التالية تحت التدفق الصفحي.
- نفخ الهواء المضغوط أو استخدم شريطا لاصقا شفافا لإزالة أي غبار من الجانب المخطط للمصفوفات. حافظ على نظافة الجانب المخطط حتى يلتصق بقوة بسطح اللوحة.
- ضع المصفوفات بحذر على أطباق بلاستيكية مقاس 6 سم عن طريق الضغط بإصبع (مصفوفة واحدة لكل طبق ؛ جانب شريطي لأسفل). تجنب ظهور فقاعات هواء بين المصفوفة والطبق. حدد موقع الخطوط على الجانب السفلي من طبق الثقافة.
- إذا فشلت المصفوفة في التوصيل ، كرر من الخطوة 1.2.
< p class = "jove_title" >
2. توليد الشريط وطلاء Laminin لثقافة الخلايا العصبية
- قم بإعداد بروتين مؤتلف مسمى بالفلورسنت (25 ميكرولتر لكل منهما للحقن [الخطوة 2.2] أو 100 ميكرولتر لكل منهما لطريقة التنسيب [الخطوة 2.2.1]) عن طريق خلط البروتين الموسوم ب FC (10-50 ميكروغرام / مل) والجسم المضاد المضاد للجسم الفلوري المضاد للجسم البشري (نسبة 1 إلى 3: 30-150 ميكروغرام / مل) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). ثم احتضن الخليط لمدة 30 دقيقة في RT.
- باستخدام حقنة 22 جم ، قم بحقن 25 ميكرولتر من البروتين المؤتلف المحضر في الخطوة السابقة (2.1) من خلال الفتحة الصغيرة الموجودة على جانب المصفوفة (الأسهم في الشكل 1A و 1C و 1E).
- بدلا من ذلك ، ضع 100 ميكرولتر من البروتين المؤتلف في الشق العلوي للمصفوفة واستنشق ما يقرب من نصف المحلول من الفتحة الصغيرة (الأسهم في الشكل 1A و 1C و 1E) ، بحيث يظل البروتين المؤتلف في المناطق المخططة.
- احتضن الطبق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا.
- ضع 300 ميكرولتر من PBS في الشق العلوي (الشكل 1 ب) واستنشق من الفتحة الصغيرة الموجودة على جانب المصفوفة (الأسهم في الشكل 1 أ و ج و ه) لإزالة البروتينات المؤتلفة غير المتصلة. لا تستنشق PBS تماما ، لأن البروتينات سوف تجف. كرر هذه الخطوة مرتين. (إجمالي 3 أضعاف)
- قم بإزالة المصفوفة بعناية وضع على الفور ~ 100 ميكرولتر من بروتين التحكم (10-50 ميكروغرام / مل ؛ FC) لتغطية المنطقة المخططة بأكملها ، مما يخلق طبقة بديلة. ثم احتضان الطبق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا.
- بعد غسل سطح الطبق ثلاث مرات باستخدام PBS ، قم بتغطيته ب ~ 100 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل من اللامينين في PBS.
ملاحظه: يجب إذابة اللامينين على الجليد لمنع التصلب.
- احتضان الطبق لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا.
- اغسل سطح الطبق ثلاث مرات باستخدام PBS وأضف وسط الثقافة. ضع الطبق المطلي بوسط الثقافة في حاضنة 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
فئة
3. زراعة الخلايا العصبية في الحصين من أجنة الفئران E15.5
- القتل الرحيم للأم عن طريق خلع عنق الرحم وعزل ثلاثة أجنة E15.5.
- قطع الجلد والجمجمة السهمية عند خط الوسط من الرأس بالمقص ، وإزالة الدماغ باستخدام ملعقة صغيرة. انقل الدماغ بعناية إلى طبق بتري مقاس 60 مم يحتوي على 3 مل من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS).
- باستخدام مشرط ، قم بقطع نصفي الكرة الأرضية بما في ذلك القشرة والحصين والمخطط (الشكل 2 أ). بعد ذلك ، قم بتشريح منطقة الحصين عن طريق إزالة السحايا بعناية ، ونقل أنسجة الحصين المقطعة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 2 مل من محلول HBSS ، على الجليد (الشكل 2B-C). اجمع 6 حصين من 3 أجنة في الأنبوب ، وهي كافية لزراعة الخلايا العصبية في 8 أطباق.
- استبدل محلول HBSS بمحلول حمض رباعي الأسيتيك التربسين / الإيثيلين ديامين (التربسين / EDTA) (2 مل) واحتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حمام مائ><ي.
ملاحظه: شفط HBSS بدون طرد مركزي ولا تصب محلول HBSS عن طريق إمالة الأنبوب.
- قم بتحييد نشاط التربسين عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من مصل الجنين البقري (FBS).
- قم بالطرد المركزي للخليط على حرارة 100 × جم لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
- قم بتحريك الحصين لأعلى ولأسفل 10 مرات في وسط استزراع باستخدام طرف 1,000 ميكرولتر مع ثقب كبير (طرف مقطوع) لفصل الأنسجة.
- قم بالتغيير إلى طرف منتظم (غير مقطوع) سعة 1,000 ميكرولتر وقم بسحب الأنسجة المفككة لأعلى ولأسفل للحصول على تعليق أحادي الخلية.
- افصل الخلايا المفردة عن طريق تمريرها عبر مصفاة خلية شبكية 80-100 ميكرومتر.
- جهاز الطرد المركزي التعليق أحادي الخلية المصفى عند 150 × جم لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط ، وأعد تعليق الحبيبات (الخلايا العصبية) في 2 مل من وسط الاستزراع.
- عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم مع تلطيخ التريبان الأزرق لتحديد الكثافة والجدوى. بعد ذلك ، قم بلوحة 10,000 خلية عصبية في 150 ميكرولتر من وسط الثقافة لكل مجموعة من الخطوط. يجب وضع التعليق بعناية لتغطية منطقة الشريط بأكملها.
