تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. إعطاء تحريض إصابات الدماغ الرضحية المتكررة (TBI)
ملاحظة: يتم تعديل معلمات TBI من التقارير السابقة، التي تم فيها تسليم تأثير TBI مرة واحدة. يطبق البروتوكول هنا نفس المعلمة ، باستثناء زيادة إجمالي عدد التأثير إلى 10.
- معدات TBI
- استخدم جهازا محمولا مصمما خصيصا لإدارة إصابات الدماغ الرضية المغلقة في الجمجمة (الشكل 1 أ) على رأس الماوس على الجانب الأيمن ، كما هو موضح في الشكل 1 ب.
- التحضير قبل الجراحة
- معدات جراحة الأوتوكلاف ، بما في ذلك المقص العادي ، والفرجار الجراحي ، ومقص الزنبرك الجراحي ، والملقط الجراحي ، وملقط البعوض ، وقطع عمود الرأس ، والشاش ، وأدوات التطبيق ذات الرؤوس القطنية.
- قم بوزن وزن جسم الفأر وتسجيله قبل 2 ساعة من الجراحة. لتقليل وذمة الدماغ أثناء زرع نافذة الجمجمة ، قم بحقن فوسفات الصوديوم ديكساميثازون بجرعة 4.8 مجم / كجم [2 مجم / مل ، عادة ~ 70 ميكرولتر (تحتاج إلى الحقن في موقعين)] في عضلة الفخذ باستخدام حقنة الأنسولين. بعد حقن ديكساميثازون، ولكن قبل البدء في جراحة إصابات الدماغ الرضية، قم بإعداد النوافذ الزجاجية كما هو موضح في الخطوة 2.1 لاستخدامها لاحقا.
- تطهير المرحلة الجراحية ومعدات إصابات الدماغ الرضية باستخدام 75٪ من الإيثانول. قم بتوسيع الستارة الجراحية المعقمة التي تستخدم لمرة واحدة لتغطية مرحلة الجراحة على المنصة التجسيمية. قم بتشغيل جهاز التسخين وجهاز مراقبة درجة الحرارة ، واضبط درجة الحرارة المستهدفة على 37 درجة مئوية.
- افتح صمام خزان الأكسجين واضبط تدفق الأكسجين على 1.5 لتر / دقيقة. افتح آلة التخدير واضبط قيمة مستوى الأيزوفلوران على ثلاثة
ملاحظة: يمكن أن يساعد الأكسجين النقي بنسبة 100٪ على النجاة من تأثيرات إصابات الدماغ الرضية.
- ضع الماوس في حجرة الحث واتركه لمدة 5 دقائق لتحقيق التخدير الكامل.
- بمجرد تخدير الماوس بالكامل (أي معدلات تنفس بطيئة ولكن ثابتة بحوالي دورة واحدة لكل ثانيتين ، إلى جانب عدم وجود منعكس قرصة الذيل) ، قم بإزالة الماوس من غرفة الحث وضع رأس الماوس في الإطار التجسيمي.
- ضع مخروط أنف أنبوب التخدير فوق أنف الفأر.
- حافظ على التخدير باستخدام 1.5٪ إيزوفلوران ممزوج بأكسجين نقي 100٪ بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة حتى نهاية الجراحة. تحقق بشكل دوري من وتيرة التنفس وقم بإعطاء قرصة الذيل أو إصبع القدم كل 15 دقيقة على الأقل طوال الجراحة لتقييم التخدير المناسب. اضبط تركيز الأيزوفلوران حسب الاقتضاء للحفاظ على عمق التخدير المطلوب.
- جراحة إصابات الدماغ الرضية
- يعطى البوبرينورفين (1 ملغم/كغ، تحت الجلد) باستخدام محاقن الأنسولين التي تستخدم لمرة واحدة ويوضع مرهم العين على عيون الفأر.
- قم بإزالة الشعر من أعلى الرأس عن طريق قصه بالمقص 1 ثم وضع عامل إزالة الشعر لمدة 1 دقيقة < br / >
تنبيه: لا تضع منتج مزيل الشعر لأكثر من 3 دقائق على فروة الرأس ، لأنه مهيج للبشرة. أيضا ، تجنب إدخال أي عامل مزيل للشعر في عيون الفأر.
- نظف بشرة فروة الرأس عن طريق وضع الشاش وأدوات التطبيق ذات الرؤوس القطنية. ثم قم بتطهير الجلد باستخدام 75٪ من الإيثانول أولا ثم البيتادين. كرر هذا ثلاث مرات (أي الإيثانول متبوعا بالبيتادين) ، مع ترك التطبيق النهائي للبيتادين على الجلد.
- أعد فحص عمق التخدير للتأكد من أن الفأر مخدر تماما (أي معدلات تنفس بطيئة ولكن ثابتة بحوالي دورة واحدة لكل ثانيتين ، إلى جانب عدم وجود منعكس قرص الذيل). ضع خيمة على الجلد بالملقط الجراحي 3 وقم بعمل شق خط الوسط بطول 12-15 مم يبدأ من حوالي 3 مم خلف العينين.
- استئصال الجلد فوق نصف الكرة الأيسر والأيمن من الجمجمة باستخدام مقص زنبركي 2.
- بمجرد انكشاف الجمجمة ، قم بإزالة السمحاق عن طريق فركه برفق باستخدام قضيب معقم برأس قطني وغسله بمحلول ملحي معقم.
- افحص حالة الجمجمة بصريا للتأكد من أنها سليمة ، باستثناء الثقبين الصغيرين اللذين تم إجراؤهما لجراحة حقن الفيروس السابقة.
- جفف منطقة الجمجمة وحدد موقع تأثير إصابات الدماغ الرضية عند الإحداثيات التالية: 2.5 مم خلف بريجما و 2 مم جانبي من الخيط السهمي إلى اليمين (الشكل 1 ب).
- قم بإزالة الماوس بسرعة من الإطار التجسيمي وضع الرأس على وسادة المخزن المؤقت أسفل جهاز TBI.
- قم بمحاذاة طرف الاصطدام مع موقع التأثير المحدد.
- ارفع العمود المعدني عن طريق سحب خيط النايلون المربوط 15 سم فوق رأس الماوس ثم حرره ، مما يسمح للوزن بالسقوط بحرية على قضيب محول الطاقة ، الذي يتلامس مع الجزء العلوي من الجمجمة في موقع TBI. لا تلمس رأس الماوس عند إحداث تأثير TBI.
- حرك الماوس على بطانية التدفئة وضعه على ظهره أثناء مراقبة حالة التنفس.
- بمجرد أن يحق الماوس نفسه من وضعية الاستلقاء إلى وضع الانبطاح ، ضعه في غرفة تحريض الأيزوفلوران لمدة ~ 5 دقائق مع 3٪ من الأيزوفلوران الممزوج بأكسجين نقي بنسبة 100٪ بمعدل تدفق 1.5 لتر / دقيقة.
- بمجرد تخدير الماوس بالكامل (أي معدلات تنفس بطيئة ولكن ثابتة بدورة واحدة تقريبا لكل ثانيتين ، إلى جانب عدم وجود منعكس قرصة الذيل) ، كرر الخطوات 1.3.9-1.3.14 لتحقيق ما مجموعه 10 تأثيرات.
ملاحظة: تم العثور على عشرة تأثيرات لإصابات الدماغ الرضية تحفز نمطا ظاهريا قويا مع انخفاض معدل وفيات الفئران في دراستنا (لم يتم نشر البيانات بعد). يمكن تعديل المعلمات لتحقيق شدة مختلفة لإصابة الدماغ عن طريق زيادة أو تقليل عدد التأثيرات و / أو الارتفاع الذي يتم إطلاق الوزن منه. تخضع جميع المعلمات لموافقة IACUC المحلية.
- افحص الجمجمة تحت المجهر الجراحي وأخرج الفأر من الدراسة في حالة حدوث كسر في الجمجمة.
- بالنسبة للجراحة الوهمية ، اتبع نفس الإجراءات الموضحة أعلاه ، بما في ذلك وضع تحت الاصطدام ولكن دون إحداث تأثيرات إصابات الدماغ الرضية.
- بعد أن يحق الماوس نفسه من وضعية الاستلقاء إلى وضعية الانبطاح بعد تأثير TBI العاشر ، ضعه في غرفة تحريض الأيزوفلوران لمدة ~ 5 دقائق. بعد ذلك، اتبع الخطوات 1.2.6-1.2.8 لوضع رأس الماوس على الإطار التجسيمي لجراحة زرع نافذة الجمجمة الموضحة أدناه.
