التلوين المناعي الفلوري للخلايا العصبية في الحصين داخل رقاقة ميكروفلويديك

الملخص

المصدر: Nagendran، T.، et al.، استخدام رقائق الموائع الدقيقة البلاستيكية المجمعة مسبقا لتقسيم الخلايا العصبية للفأر الأولية. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو تلطيخ التألق المناعي للخلايا العصبية في الحصين الفئران المزروعة داخل شريحة ميكروفلويديك لتحليل نضوج الخلايا العصبية والاتصال.

البروتوكول

فئة < p = "jove_title" >1. التلوين المناعي الفلوري داخل الرقاقة

1. تحضير محلول تثبيت الفورمالديهايد بنسبة 4٪ في PBS (4٪ فورمالديهايد ، 1 ميكرومتر MgCl₂ ، 0.1 ميكرومتر CaCl₂ ، 120 ملي من السكروز)
2. قم بإزالة معظم الوسائط الموجودة في آبار الرقاقة (لا تجفف المقصورات الداخلية).
3. أضف على الفور 100 ميكرولتر من محلول التثبيت إلى الآبار العلوية للمقصورات المحورية والجسدية.
4. بعد 1 دقيقة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التثبيت إلى الآبار السفلية. إصلاح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
5. قم بإزالة معظم المحلول من آبار الرقاقة (لا تجفف المقصورات الداخلية). أضف على الفور 150 ميكرولتر من PBS إلى كل من الآبار العلوية للمقصورات المحورية والجسدية. انتظر 2 دقيقة حتى يتدفق PBS إلى الآبار السفلية.
6. كرر الخطوة 1.5 مرتين.
7. قم بإزالة معظم PBS من آبار الشريحة. أضف على الفور 150 ميكرولتر من PBS مع 0.25٪ TritonX-100 إلى كل من الآبار العلوية للمقصورات المحورية والجسدية. انتظر لمدة 15 دقيقة.
8. قم بإزالة معظم السائل من آبار الرقاقة وأضف على الفور 150 ميكرولتر من محلول المانع (10٪ مصل ماعز عادي في PBS) إلى كل من الآبار العلوية للمقصورات المحورية والجسدية. انتظر لمدة 15 دقيقة < / > ملاحظه: يجب أن تكون محاليل الحجب الفعالة خاصة بالجسم المضاد الثانوي ، على سبيل المثال ، بالنسبة للجسم المضاد الثانوي للحمار المضاد للأغنام ، استخدم مصل الحمار في محلول الحظر.
9. قم بإزالة معظم السائل من آبار الرقاقة وأضف على الفور 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية (أو الأجسام المضادة) في مصل الماعز العادي بنسبة 1٪ في PBS إلى كل من الآبار العلوية للمقصورات المحورية والجسدية. قم بتغطيته لتقليل التبخر وانتظر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية طوال الليل.
10. قم بإزالة معظم المحلول من آبار الرقاقة (لا تجفف المقصورات الداخلية). أضف على الفور 150 ميكرولتر من PBS إلى كل من الآبار العلوية للمقصورات المحورية والجسدية. انتظر 5 دقائق حتى يتدفق PBS إلى الآبار السفلية.
11. كرر الخطوة 1.10 مرتين.
12. قم بإزالة معظم السائل من آبار الرقاقة وأضف على الفور 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (أو الأجسام المضادة) في PBS إلى كل من الآبار العلوية للمقصورات المحورية والجسدية. قم بتغطيته لتقليل التبخر وانتظر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظه: راجع تعليمات الشركة المصنعة للتخفيف الموصى به للأجسام المضادة الثانوية.
13. كرر الخطوات 1.10-1.11.
14. في حالة التصوير في غضون يوم واحد من التلوين المناعي ، احتفظ بالشريحة مملوءة ب PBS. إذا تم تخزين الشريحة لمدة تزيد عن يوم واحد قبل التصوير ، فقم بلف الطبق الذي يحتوي على الشريحة في غشاء البارافين لمنع التبخر وتخزينه في 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للتصوير.
15. لتخزين العينات على المدى الطويل ، يمكن استخدام وسائط التركيب (على سبيل المثال ، Fluoromount-G).
    1. قم بإزالة معظم السائل من آبار الرقاقة. استخدم ماصة بلاستيكية يمكن التخلص منها سعة 1 مل لإضافة قطرتين من وسائط التركيب إلى كل من الآبار العلوية للمقصورات المحورية والجسدية.
    2. قم بإمالة الشريحة لتشجيع تدفق وسائط التركيب عبر القنوات. بعد 5 دقائق ، أضف 2 قطرات إلى الآبار السفلية. انتظر لمدة 1 ساعة قبل التصوير.
       ملاحظه: بعد استخدام وسائط التركيب ، لن يكون من الممكن إعادة التحقيق بحثا عن أهداف أخرى.

المواد