القياس الكمي للأكتين الخيطي في الخلايا العصبية القشرية للفئران

الملخص

المصدر: Li, H., et al. القياس الكمي للأكتين الخيطي (F-actin) Puncta في الخلايا العصبية القشرية للفئران. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو إجراء تلطيخ الخلايا العصبية القشرية للفئران بالفلورسنت للفحص المجهري. يستهدف البروتينات F-actin والبروتينات المتغصنة لتحليل السلامة الهيكلية وحساب كثافة F-actin ، وهو أمر بالغ الأهمية لدراسة وظيفة الخلايا العصبية وصحتها.

البروتوكول

فئة

1. وضع العلامات الفلورية والكيمياء المناعية

< p class = "jove_content" >ملاحظة: تم إجراء وضع العلامات على الفلورسنت المناعي لمزارع الخلايا القشرية الأولية في أطباق زراعة الخلايا ذات القاع الزجاجي مقاس 35 مم بحجم عمل 1 مل.

1. اغسل الطبق ذو القاع الزجاجي مرتين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات درجة الحموضة 7.4 (PBS).
2. قم بإصلاح الخلايا التي تحتوي على 4٪ بارافورمالدهايد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
3. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS وتخلل 0.1٪ Triton X-100 في PBS لمدة 5 دقائق.
4. عالج الخلايا لمدة 20 دقيقة في RT ببقعة F (خيطية) خاصة بالأكتين ، AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40 ، 25 ميكرولتر من الفالودين في 1 مل PBS).
5. اشطف الخلايا مرتين باستخدام PBS وقم بحظر مصل الماعز العادي بنسبة 10٪ في RT لمدة 1-2 ساعة.
6. قم بتخفيف الجسم المضاد متعدد النسيلة للدجاج المضاد ل MAP2 (البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 2) (1: 2،500) في PBS مع مصل الماعز العادي بنسبة 2٪ واحتضان O / N (بين عشية وضحاها) عند 4 ⁰درجة مئوية.
7. بعد الحضانة ، اشطفها في PBS مرتين.
8. تمييع الجسم المضاد الثانوي (Alexa Red 594-congulgated goat anti-chicken IgG (1: 500) مع مصل الماعز العادي بنسبة 2٪ واحتضانه لمدة ساعتين في RT.
9. اشطفها باستخدام PBS وأضف 10 ميكرولتر / طبق من صبغة Hoescht.
10. احتضن لمدة 3 دقائق في RT واغسلها باستخدام PBS مرتين.
    ملاحظه: الخلايا المسماة جاهزة الآن للخطوة 2 (عد النقاط النقطية F-actin).
11. احتفظ بعينة الخلية ب 100 ميكرولتر من الكاشف المضاد للبهتان كعامل غطاء واحتفظ بها عند 4 ⁰درجة مئوية في الظلام للتخزين طويل الأجل.
    ملاحظه: الفالودين مستقر نسبيا في PBS عند +4 درجة مئوية في الظلام لمدة تصل إلى أسبوع واحد ، ويمكن الحفاظ على التألق باستخدام كواشف الانزلاق المضادة للبهتان. ومع ذلك ، يتم الحصول على الصور المثلى من 1-3 أيام بعد التلوين لأن الفالودين قد يبدأ في الانتشار مع التخزين الممتد.

< p class = "jove_title" >2. F-actin Puncta Counting

1. قم بتشغيل المجهر الفلوري وقم بالتبديل إلى هدف 20×. افتح برنامج المجهر وقم بإعداد البرنامج بحجم صورة 1280×960 بكسل ودقة صورة 0.17 ميكرومتر / بكسل عند تكبير 1×.
2. احصل على صور للخلايا العصبية F-actin / MAP2 ذات العلامات المشتركة تحت قنوات الفلورسنت الخضراء (495 نانومتر) أو الحمراء (613 نانومتر).
3. اختر 5 صور فلورية خضراء (F-actin) / حمراء (MAP2) ذات علامة مناعية / زرقاء (Hoescht) للخلايا العصبية الفردية ذات العرش المتغصنة المحددة بوضوح.
4. تحديد الهياكل الغنية بالأكتين F في الجزء المتغصن من الدرجة الثانية (نطاق الطول 25-75 ميكرومتر) مع التألق المناعي MAP2 المستمر.
5. قم بتدوير المنطقة المحددة من الصور إلى مستوى أفقي. انسخ والصق كصورة جديدة.
6. اطرح خلفية الصور باستخدام تعديل ثابت لكل طبق.
7. احسب نقطي F-actin الأخضر الفاتح وتتبع طول الجزء الشجيري المحدد يدويا بواسطة مراقبين مستقلين مدربين. تصدير البيانات إلى ملف جدول بيانات.
8. احسب الكثافة بقسمة إجمالي F-actin المسمى puncta (N) على الطول (L) للتشعبات المسماة MAP2. التعبير عن البيانات كعدد F-actin puncta لكل 10 ميكرومتر من التغصنات
   ملاحظه: تم تضمين النقاط (الحجم ≤1.5 ميكرومتر) من مضان F-actin مع كثافة قصوى لا تقل عن 50٪ فوق متوسط شدة التلوين في العمود الشجيري في كل جزء شجيري محدد.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 35 مم صحون قاع زجاجي رقم 1.5 غطاء زجاجي شركة ماتتك P35G-1.5-20-C DMEM / F12 متوسط تقنيات الحياة هاتف: 10565-018 بولي L-يسين سيغما ص 9155 بارافورمالدهيد سيغما ص 6148 أليكسا فلور 488 فالودين تقنيات الحياة أ 12379 مصل الحصان العادي تقنيات الحياة هاتف: 26050-070 دجاج متعدد النسيلة مضاد ل MAP2 أبكام أب92434 Alexa Red 594 الماعز المترافق مضاد للدجاج IgG تقنيات الحياة أ 11042 NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 تقنيات الحياة R37605 حزمة برامج NIS-Elements نيكون إنسترومنتستر نيكون Eclipse TE2000-E مجهر فلوري مقلوب يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر نيكون إنسترومنتستر