تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
< p class = "jove_title" >
1. حصاد الأنسجة وتنقية الأميلويد
ملاحظة: من الناحية المثالية ، يجب عزل ألياف الأميلويد من مناطق الدماغ التي تم تشريحها حديثا. ومع ذلك ، تعمل هذه الطريقة أيضا بشكل جيد مع أنسجة المخ المجمدة أو المجمدة. يوجد أدناه مخطط موجز لأنسجة المخ المجمدة لتخزينها لاستخدامها في وقت لاحق.
- حصاد أنسجة المخ وتخزينها: قم بتشريح أدمغة الفئران وحصاد المناطق المحملة بالأميلويد بسرعة (مثل القشرة والحصين) ، متبوعا بالتجميد المفاجئ في النيتروجين السائل أو حمام الكحول الجليدي الجاف.
ملاحظه: يساعد التجميد المفاجئ في الحفاظ على السمات الهيكلية لمكونات الأنسجة. يتم القتل الرحيم للفئران عن طريق الأيزوفلوران وخلع عنق الرحم. ينصح بتجنب استخدام ثاني أكسيد الكربون2 لأن ذلك يمكن أن يضر بسلامة بروتين الدماغ.
- بعد تشريح الأنسجة الطازجة وقطعها وتخزينها في كتل صغيرة (على سبيل المثال ، 5 مم × 5 مم) ، لأن هذا يسهل تجانس أكثر كفاءة قبل استخراج الأميلويد. انقل الأنسجة إلى القارورة المبردة المعقمة ، وشد غطاءها ، واغمرها بسرعة.
- احتفظ بالأنسجة المجمدة في ظروف شديدة البرودة (أي -80 درجة مئوية أو النيتروجين السائل). إذا كان سيتم إجراء الاستخراج بعد بضعة أيام ، فقم بتخزين الأنسجة عند -20 درجة مئوية وتجنب دورات التجميد والذوبان. قم بإذابة الأنسجة المجمدة على الثلج الرطب عندما تكون جاهزة للاستخراج والتنقية.
ملاحظه: يمكن أن يتسبب الاتصال المباشر للأنسجة بالنيتروجين السائل في تلف الأنسجة والبروتينات. لاحظ أن حمام الكحول يمكن أن يزيل علامات دائمة من ملصقات الأنبوب.
< p class = "jove_title" >
2. تخصيب المواد غير القابلة للذوبان من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)
ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات على الجليد وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، ما لم ينص على خلاف ذلك. يتم توفير المصنعين وأرقام كتالوج المواد الكيميائية والأدوات في جدول المواد.
- ابدأ بمناطق أنسجة المخ التي تم تشريحها حديثا أو المجمدة (مذابة على الثلج) موضوعة في أنبوب سعة 2 مل يحتوي على 6-8 حبات خزفية ومخزن تجانس مثلج طازج (1 مل لكل 0.25-1 جم من كتلة الأنسجة الرطبة).
- انقل الأنابيب إلى الخالط مطحنة الخرزة وطحن محتويات الأنسجة عند 4000 دورة في الدقيقة ، مع دورتين مدة كل منهما 30 ثانية وفاصل 30 ثانية بينهما.
ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام أنظمة النمام أو الخالط الآلية لطحن الأنسجة وتجانسها.
- أضف 9 مل من محلول التجانس المثلج البارد إلى 1 مل من أنسجة الدماغ الكاملة المتجانسة في أنابيب سعة 15 مل ، وأغلقها بشرائط غشاء شمع مختبرية ، وقم بتدويرها من طرف إلى طرف طوال الليل عند 4 درجات مئوية لضمان الذوبان القوي.
ملاحظه: لإزالة الحطام الخلوي الكبير غير المرغوب فيه والدهون ، في صباح اليوم التالي ، قم بتدوير الأنابيب عند 800 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق وجمع المادة الطافية في أنبوب جديد. أعد تعليق الحبيبات المتبقية في 2 مل من المخزن المؤقت للتجانس المثلج البارد ، واخلطها جيدا ، وقم بالدوران مرة أخرى لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، واجمع بين الطافتين.
- أضف السكروز الصلب ببطء إلى تعليق مستخلص الأنسجة إلى تركيز نهائي يبلغ 1.2 متر ، واخلطه جيدا ، وجهاز الطرد المركزي عند 250.000 × جم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها بعناية باستخدام ماصة. أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من مخزن التجانس الذي يحتوي على 1.9 M من السكروز عن طريق الترتيور, متبوعا بالطرد المركزي عند 125,000 × جم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظه: يمكن ضبط حجم المخزن المؤقت بناء على كمية المواد المستردة من الخطوة السابقة. بشكل عام ، تعتبر 10 مجلدات من المخزن المؤقت للتجانس (V / V) مثالية لهذه الخطوة.
- اجمع الطبقة الصلبة البيضاء العلوية باستخدام ماصة، وانقلها إلى أنبوب جديد، وقم بإذابتها في 1 مل من محلول الغسيل المثلج البارد عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل عدة مرات، دون إدخال فقاعات هواء.
- بصرف النظر عن الطبقة العليا ، يتم إثراء الحبيبات أيضا بألياف الأميلويد. للحصول على عائد أعلى ، اجمع الكسرين وتابع. قم بإزالة الطبقة المائية الوسطى بعناية باستخدام ماصة وتخلص منها.
- جهاز الطرد المركزي الكسور المجمعة عند 8000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- أضف 1 مل من محلول الهضم المثلج إلى الحبيبات المغسولة ، وأعد تعليقها ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 3 ساعات.
- جهاز طرد مركزي عند 8000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية وإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة.
- أعد تعليق وغسل الحبيبات المهضومة مرتين في 1 مل من محلول تريس المثلج.
- أعد تعليق الحبيبات المغسولة في 1 مل من المخزن المؤقت للذوبان الذي يحتوي على 1٪ SDS و 1.3 M سكروز عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. جهاز الطرد المركزي بسرعة عند 200,000 × جم لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظه: على الرغم من أن ألياف الأميلويد شديدة المقاومة للمنظفات والمواد الممسحة ، إلا أن التعرض الطويل جدا للمنظف (1٪ SDS) قد يؤثر على سلامة الألياف أو يزيل البروتينات المرتبطة بإحكام ، مما سيضر بالتحليلات اللاحقة. لذلك ، مباشرة بعد تعليق الكريات ، انتقل إلى الطرد المركزي.
- احفظ الحبيبات وقم بزيادة حجم المادة الطافية المتبقية عن طريق إضافة 50 ملي مولار من المخزن المؤقت Tris (بنسبة 1: 0.3) لتقليل تركيز السكروز من 1.3 إلى 1 متر وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 200,000 × جم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- قم بإذابة الكريتين في 100 ميكرولتر من محلول Tris الذي يحتوي على 0.5٪ SDS وتجمع لتنقية الأميلويد. الكريات المرئية صغيرة ويجب أن تظهر معتمة وبيضاء (انظر الشكل 1 أ).
