مقالة منهجية

تقييم استجابة الخلايا العصبية الداخلية للإشارات الجذابة للكيماويكولوجيا من الخلايا البطانية المحيطة بالبطينات

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Datta, D., et al. فحوصات الهجرة والجذب الكيميائي والزراعة المشتركة للخلايا البطانية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية والخلايا العصبية GABAergic. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو طريقة لاختبار هجرة الخلايا العصبية الداخلية استجابة لإشارات جذابة كيميائية من الخلايا البطانية حول البطينين (PVECs). يتم وضع الخلايا العصبية الداخلية في حجرة مركزية ، مع وجود PVECs وخلايا التحكم على كلا الجانبين. تشير زيادة الهجرة نحو PVECs إلى استجابة إيجابية لإشاراتها الجذابة الكيميائية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. فحص الجذب الكيميائي

  1. ضع حشوة ثقافة بثلاثة آبار في وسط طبق بولي إل أورنيثين / لامينين مطلي ب 35 مم باستخدام ملاقط معقمة.
  2. اقلب الطبق رأسا على عقب. ضع علامة على الحدود حول الجزء الأوسط من الملحق باستخدام علامة سوداء دائمة بطرف فائق الدقة.
  3. بذرة 3 × 104 خلايا عصبية داخلية بشرية GABAergic في المقصورة الوسطى في 70 ميكرولتر من الوسط العصبي (الشكل 1 أ).
  4. البذور 104 خلايا بطانة بشرية حول البطينين في 70 ميكرولتر من وسط الخلية البطانية حول البطينين و 104 خلايا بطانية تحكم في 70 ميكرولتر من وسط الخلية البطانية للتحكم في المقصورتين الخارجيتين ، على التوالي (الشكل 1 أ).
  5. أضف 1 مل من وسط الزراعة المشتركة (50٪ وسط صيانة حول البطين بدون GABA و 50٪ وسط عصبي) على طول جانب الطبق لمنع الطلاء الموجود على الطبق من الجفاف.
  6. تحقق تحت المجهر للتحقق من عدم تسرب الخلايا من حجرة الإدخال.
  7. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. بعد 24 ساعة من الحضانة ، تحقق تحت المجهر للتحقق من أن الخلايا قد تلتصق بشكل صحيح وأنه لا يوجد تسرب.
  8. بعد 48 ساعة من البذر ، قم بإزالة الملحق برفق باستخدام ملقط معقم. تحقق تحت المجهر للتحقق من عدم إزعاج طبقة الخلية (اليوم 0).
  9. قم بإزالة الوسط وأضف 1 مل من وسط الزراعة المشتركة الطازجة.
    ملاحظة: خصص العدد المطلوب من الأطباق لصور اليوم 0.
  10. احتضان الخلايا لمدة 36 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. بعد 36 ساعة ، قم بالشفط المتوسط ، وقم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ PFA لمدة 10 دقائق ، واغسل 3x باستخدام 1x PBS.
  11. تلطيخ الخلايا العصبية الداخلية GABAergic البشرية مع الأجسام المضادة للإنسان β-Tubulin أو الأجسام المضادة MAP2 المضادة للإنسان. في نهاية إجراء التلوين ، أضف 1 مل من وسط التثبيت المضاد للبهتان إلى كل طبق.
< p class = "jove_title" >2. التصوير وتحليل البيانات

  1. ضع طبق الفحص الملطخ بالمناعة تحت المجهر بتكبير 4X.
  2. احتفظ بحافة طويلة واحدة للحدود المستطيلة (تم إجراؤها في الخطوة 5.10 أعلاه) في مجال الرؤية. التقط صورا للخلايا في المساحة الخالية من الخلايا المجاورة لتلك الحدود. احصل على صور على طول الحافة الطويلة اليمنى والحافة الطويلة اليسرى للحدود المستطيلة.
    ملاحظة: لا يتم النظر في الخلايا الموضوعة قطريا فيما يتعلق بالمستطيل بسبب الغموض في اختيار الحافة القصيرة أو الطويلة كعلامة البداية. أيضا ، غالبا ما تكون أعداد الخلايا التي تهاجر عبر الحافة القصيرة أقل بكثير (ربما بسبب عدد أقل من خلايا البداية على طول الحافة القصيرة) ولا يتم أخذها في الاعتبار.
  3. افتح الصور في ImageJ. احسب المسافة بين كل خلية وعلامة الحدود باستخدام ImageJ.
  4. لتقييم الترحيل من حيث أرقام الخلايا ، قم بتعيين مسافة محددة من الحدود في الصورة المكتسبة في ImageJ. احسب عدد الخلايا الموجودة ضمن هذه المسافة. حساب متوسط الرقم ، ديفيا القياسية
  5. وأهمية إحصائية باستخدام البرامج المناسبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: اختبار الجذب الكيميائي. (أ) مخطط اختبار الجذب الكيميائي. باستخدام إدراج ثقافة ثلاثية الآبار ، تم زرع الخلايا العصبية الداخلية (IN) في المنتصف (مستطيل أخضر منقط) ، بينما تم زرع الخلايا البطانية حول البطينين (PV ECs ؛ مستطيل برتقالي منقط) والخلايا البطانية الضابطة (ECs ؛ مستطيل أصفر منقط) على كلا الجانبين. (ب) صور للخلايا العصبية الداخلية المسماة β-Tubulin تظهر هجرة قوية نحو الخلايا البطانية ح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات السيطرة على الخلايا البطانية البشرية الديناميكيات الخلوية التوصية 1022 مكمل التحكم في الخلايا البطانية المتوسطة الديناميكيات الخلوية م 1019 DMEMF / 12 متوسط ثيرموفيشر العلمي 11320033 E6 متوسط ثيرموفيشر العلمي A1516401 FGF2 ثيرموفيشر العلمي PHG0261 فيبرونيكتين ثيرموفيشر العلمي 33016-015 GABA سيجما ألدريتش أ 2129 مقياس الدم سيجما ألدريتش Z359629 الخلايا العصبية GABAergic البشرية الديناميكيات الخلوية R1013 الخلايا العصبية البشرية GABAergic قاعدة المتوسطة الديناميكيات الخلوية M1010 الملحق العصبي العصبي GABAergic البشري الديناميكيات الخلوية م 1032 لامينين سيغما L2020 تصاعد متوسط مختبرات النواقل إتش-1200 بولي إل أورنيثين سيغما ص 4957 برنامج تلفزيوني ثيرموفيشر العلمي 14190 فيجف أ بيبروتك 100-20 مجموعة VascuLife VEGF المتوسطة الكاملة تقنيات خلايا شريان الحياة ل ل -0003 مكون من وسيط الخلية البطانية البشرية للتحكم 3 - ثقافة سيليكون جيدا - إدراج المرجع نفسه 80369 طبق 35 مم كورنينج 430165 محلول PFA 4٪ فيشر ساينتيك AAJ19943K2 مجهر تباين الطور المقلوب زييس زايس أكسيفيرت 40 ج مجهر الفلورسنت أوليمبوس إف إس إكس-100 الأجسام المضادة β-Tubulin المضادة للإنسان بيوليجند 802001 الأجسام المضادة MAP2 علم الأعصاب CH22103

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة