الترسيب المناعي لمجمعات البروتين والحمض النووي المستهدفة من تحلل الخلايا العصبية الحركية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Montanera ، K. N. et al. ، Rhee ، H. S. رسم خرائط عالية الدقة لتفاعلات البروتين والحمض النووي في الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية للفأر باستخدام الكروماتين للترسيب المناعي - نوكلياز خارجي (ChIP-Exo). J. Vis. إكسب. (2020)

يوضح هذا الفيديو الترسيب المناعي لشظايا الحمض النووي المتشابكة مع البروتين المستهدف من تحلل الخلايا العصبية الحركية المشتقة من الخلايا الجذعية باستخدام حبات مغناطيسية مطلية بالأجسام المضادة الخاصة بالبروتين المستهدف.

البروتوكول

ملاحظة: يوصى باستخدام الماء المقطر ومنزوع الأيونات المعقم (ddH₂O) لعمل المخازن المؤقتة وخلطات التفاعل الرئيسية.

< p class = "jove_title" >1. حصاد الخلايا وتشابك

الخلايا

1. بعد تمييز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (ES) إلى خلايا عصبية ما بعد الانقسام ، أضف 11٪ فورمالديهايد إلى الخلايا المحصودة إلى تركيز نهائي قدره 1٪ (حجم / حجم). الخلايا الصخرية على منصة هزاز (هزاز أو شاكر أو دوار) لمدة 15 دقيقة ، في درجة حرارة الغرفة (RT ، 25 درجة مئوية).
   ملاحظه: اعتمادا على البروتين المستهدف المراد تشابكه ، يمكن استخدام تشابك أقل من الفورمالديهايد (على سبيل المثال ، تركيز نهائي قدره 0.5٪) أو تشابك....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Agarose ، UltraPure إنفيتروجين 16500 فحص صوتية (القسم 4.3.6) الألبومين، مصل البقر (BSA)، خال من البروتينيز، عزل الصدمات الحرارية، 98٪ على الأقل بيو شوب ألب 003 حل الحجب الجسم المضاد ضد Isl1 دي إس إتش بي 39.3F7 تحرسان الأجسام المضادة بالخرز (القسم 5.6) بيوروبتور بيكو دياجينود B01060010 صوتنة الكروماتين (القسم 3.3) جهاز طرد مركزي 5424 R إيبندورف 5404000138 صوتنة الكروماتين (القسم 3.5) ، فحص صوتنة (القسم 4.3.1 و 4.3.3 و 4.3.4) جهاز طرد مركزي 5804 R إيبندورف 22623508 حصاد الخلايا والربط المتقاطع والتجميد (القسم 1.3) ، تحلل الخلايا (القسم 2.2 و 2.3) ، صوتنة الكروماتين (القسم 3.1) كوكتيل مثبط البروتياز الكامل الخالي من EDTA روش 4693159001 تمت إضافته إلى جميع المخازن المؤقتة ، باستثناء المخزن المؤقت Proteinase K و ChIP Elution buffer ملح الصوديوم بحمض ديوكسيكوليك فيشر علمي ص349 عازلة التحلل 3 ، عازلة غسيل عالية الملح ومخزن غسيل LiCl EDTA، 0.5 م، محلول معقم، درجة الحموضة 8.0 بيو شوب EDT111 المخزن المؤقت للتحلل 1-3 ، فحص صوتنة (القسم 4.1) ، المخزن المؤقت لغسل الملح العالي ، المخزن المؤقت لغسيل LiCl ومخزن الوخزة المضاربة ChIP الكحول الإيثيلي اللامائي ، 100٪ الكحوليات التجارية P006EAAN فحص صوتية (القسم 4.3.3) الفورمالديهايد ، 36.5-38٪ ، يحتوي على 10-15٪ ميثانول سيغما F8775 حصاد الخلايا والربط المتقاطع والتجميد (القسم 1.1) الجلسرين ، درجة الكاشف ، 99.5٪ كحد أدنى بيو شوب GLY002 عازلة التحلل 1 جلايسين، درجة التكنولوجيا الحيوية، 99٪ على الأقل بيو شوب GLN001 خلايا الحصاد والربط المتبادل والتجميد (القسم 1.2) الجليكوجين ، درجة الحمض النووي الريبي الترمو: العلمية R0551 فحص صوتية (القسم 4.3.3) HEPES ، محلول معقم مفلتر 1 متر ، درجة الحموضة 7.3 بيو شوب هيب 003 عازلة التحلل 1 ، عازلة غسيل عالية الملح كلوريد الليثيوم (LiCl) ، درجة الكاشف بيوشوب إضاءة704 LiCl غسل العازلة الخرز المغناطيسي ل ChIP (Dynabeads Protein G) Dynabeads Protein G (حبات مغناطيسية ل ChIP) Dynabeads Protein G (حبات مغناطيسية ل ChIP) حضانة الأجسام المضادة بالخرز (القسم 5) رف مغناطيسي (مغناطيس DynaMag-2) إنفيتروجين 12321 د تستخدم في العديد من الخطوات في الأقسام: 5 محلول ملح الصوديوم N-Lauroylsarcosine ، محلول مائي 30٪ ، ≥97.0٪ (HPLC) سيغما 61747 [م] عازلة التحلل 3 أوكتيل فينول إيثوكسيلات (إيجيبال CA630) بيو شوب غير 999 Lysis Buffer 1 و LiCl Wash Buffer الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل ، درجة التكنولوجيا الحيوية (25: 24: 1) بيو شوب رقم التعريف الشخصي 512 التحقق من صوتنة (القسم 4.3.1) محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، 1x كورنينج 21040 سي في خلايا الحصاد والربط المتقاطع والتجميد (القسم 1.3) وصوتنة الكروماتين (القسم 3.1) ، تحرس الأجسام المضادة بالخرز (القسم 5.1) مزود الطاقة الأساسي PowerPac بيورراد 1645050 فحص صوتية (القسم 4.3.6) محلول البروتيناز K ، درجة الحمض النووي الريبي إنفيتروجين 25530049 التحقق من صوتية (القسم 4.2) خالي من Rnase A و Dnase و Protease الترمو: العلمية البريد الإلكتروني: EN0531 فحص صوتية (القسم 4.3.2) كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) ، الكاشف الحيوي سيغما S5886 عازلة التحلل 1-3 ، عازلة غسيل عالية الملح كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، درجة الرحلان الكهربائي بيو شوب SDS001 فحص صوتنة (القسم 4.1) ، عازلة غسيل عالية الملح ومخزن مؤقت شطف ChIP حبات صوتنة وأنابيب Bioruptor سعة 15 مل دياجينود C01020031 صوتنة الكروماتين (القسم 3.1 و 3.2) خلاط حراري F1.5 إيبندورف 5384000020 الأقسام 4.2 و 4.3.2 و 4.3.5 محلول هيدروكلوريد Trizma (Tris-HCl) ، معتمد من BioPerformance ، 1 متر ، درجة الحموضة 7.4 سيغما تي 2194 10 ملي مولار Tris-HCl عازلة محلول تريزما هيدروكلوريد (Tris-HCl)، معتمد من الأداء الحيوي، 1 متر، درجة الحموضة 8.0 سيغما تي 2694 المخزن المؤقت للتحلل 2 ، المخزن المؤقت للتحلل 3 ، فحص صوتنة (القسم 4.1) ، مخزن الغسيل LiCl ومخزن الحذف ChIP VWR Mini Tube Rocker ، متغير السرعة VWR 10159-752 تستخدم في العديد من الخطوات في الأقسام: 1 و 2 و 5 و 6 و 7 2- [4- (2،4،4-trimethylpentan-2-yl) الفينوكسي] الإيثانول ، تريتون X-100 ، درجة الكاشف بيو شوب TRX506 عازلة التحلل 1 ، الكروماتين الصوتي (القسم 3.4) ومحلول غسيل عالي الملح