الترسيب المناعي لمجمعات البروتين والحمض النووي المستهدفة من تحلل الخلايا العصبية الحركية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Montanera ، K. N. et al. ، Rhee ، H. S. رسم خرائط عالية الدقة لتفاعلات البروتين والحمض النووي في الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية للفأر باستخدام الكروماتين للترسيب المناعي - نوكلياز خارجي (ChIP-Exo). J. Vis. إكسب. (2020)

يوضح هذا الفيديو الترسيب المناعي لشظايا الحمض النووي المتشابكة مع البروتين المستهدف من تحلل الخلايا العصبية الحركية المشتقة من الخلايا الجذعية باستخدام حبات مغناطيسية مطلية بالأجسام المضادة الخاصة بالبروتين المستهدف.

البروتوكول

ملاحظة: يوصى باستخدام الماء المقطر ومنزوع الأيونات المعقم (ddH₂O) لعمل المخازن المؤقتة وخلطات التفاعل الرئيسية.

< p class = "jove_title" >1. حصاد الخلايا وتشابك

الخلايا

1. بعد تمييز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (ES) إلى خلايا عصبية ما بعد الانقسام ، أضف 11٪ فورمالديهايد إلى الخلايا المحصودة إلى تركيز نهائي قدره 1٪ (حجم / حجم). الخلايا الصخرية على منصة هزاز (هزاز أو شاكر أو دوار) لمدة 15 دقيقة ، في درجة حرارة الغرفة (RT ، 25 درجة مئوية).
   ملاحظه: اعتمادا على البروتين المستهدف المراد تشابكه ، يمكن استخدام تشابك أقل من الفورمالديهايد (على سبيل المثال ، تركيز نهائي قدره 0.5٪) أو تشابك مزدوج مع غلوتارات ديسكسينيميديل (DSG).
2. أضف 2.5 مليون جلايسين إلى التركيز النهائي البالغ 150 ملي مولار لإيقاف تفاعل التشابك. الخلايا الصخرية على منصة هزازة في RT ، لمدة 5 دقائق.
3. الطرد المركزي الخلايا المتشابكة في أنابيب مخروطية 15 مل في RT ، لمدة 6 دقائق ، عند 1,350 × جم. قم بشفط المحلول ، ثم أعد تعليق الخلايا في 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS).
   ملاحظه: يمكن تخزين كريات الخلايا المتشابكة عند -80 درجة مئوية بعد التجميد السريع بالنيتروجين السائل.

< p class = "jove_title" >2. تحلل الخلية

ملاحظة: الخطوات التالية في هذا البروتوكول هي ما يقرب من 2 × 10⁷ خلايا عصبية متمايزة عن خلايا ES للفأر. لكسر الخلايا المفتوحة ، سيتم استخدام مخازن التحلل التي تحتوي على منظفات مختلفة. أضف 50 ميكرولتر من مخزون مثبطات الإنزيم البروتيني الكامل (CPI) بمعدل 1000 مرة إلى 50 مل من المخزن المؤقت قبل الاستخدام مباشرة.

1. قم بإعداد مخازن التحلل 1-3 كما هو موضح في الجدول 1.
2. قم بإذابة كريات الخلايا المتشابكة على الجليد ، ثم قم بإعادة تعليق كريات الخلايا تماما في 3 مل من المخزن المؤقت للتحلل 1 في 15 مل من الأنابيب المخروطية الشكل. صخور عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة على منصة هزازة. جهاز طرد مركزي عند 1,350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وشفط الطاف.
3. أعد تعليق الخلايا المحببة تماما في 3 مل من محلول التحلل 2. صخور عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق على منصة هزازة. جهاز طرد مركزي عند 1,350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وشفط الطاف.
4. أضف 1 مل من محلول التحلل 3 إلى كل حبيبات ، ثم احتفظ بها على الثلج. انتقل على الفور إلى الصوتنة.

< p class = "jove_title" >3. صوتنة الكروماتين

< p class = "jove_content" >ملاحظة: احتفظ بالعينات على الجليد أو عند 4 درجات مئوية أثناء إجراء الصوتنة هذا لتقليل انعكاس الارتباط المتقاطع.

1. باستخدام ملعقة معقمة ، أضف حبات صوتنة (جدول المواد) حتى علامة التخرج 0.2 مل على أنابيب البوليسترين سعة 15 مل. اغسل حبات صوتنة عن طريق الدوامة في 600 ميكرولتر من 1x PBS حتى لا تظهر أي بقع جافة. الطرد المركزي الأنابيب لمدة 5 ثوان عند 30 × جم والشفط 1x PBS.
   ملاحظه: صوتنة في أنابيب البوليسترين أكثر كفاءة من الصوتنة في أنابيب البولي بروبلين. إذا كان عدد أقل من الخلايا (على سبيل المثال ، <10⁶ خلايا) صوتنة ، فاستخدم أنابيب البوليسترين 1.5 مل دون إضافة حبات صوتنة.
2. أعد تعليق المحللات النووية تماما في 1 مل من المخزن المؤقت للتحلل 3 (من الخطوة 2.4) ، ثم انقلها إلى أنابيب البوليسترين سعة 15 مل التي تحتوي على حبات صوتنة. لفترة وجيزة دوامة أنابيب البوليسترين.
3. لتجزئة الحمض النووي للكروماتين المتشابك ، يقوم بالتحلل النووي بالصوتنة عند 4 درجات مئوية لعدد ممثل من الدورات ، مع سعة الطاقة عند 30 واط ، ودورات صوتنة مضبوطة على 30 ثانية / 30 ثانية قبالة.
   ملاحظه: سيؤدي تحسين الصوتنة لكل نوع خلية ودفعة إلى أفضل إنتاجية للهروب المناعي للكروماتين - نوكلياز خارجي (ChIP-exo). بالنسبة للخلايا العصبية الفأرية 2 × 10 7 ، فإن 20-30 دورة صوتنة في الإعدادات المذكورة ستقوم بتجزئة الكروماتين في حدود 100-500 نقطة أساس.
4. بعد اكتمال الصوتنة ، انقل كل المواد الطافية (المحللات الموبعة) ، من كل عينة ، إلى أنابيب 1.5 مل. أضف 10٪ 2- [4- (2،4،4-trimethylpentan-2-yl) فينوكسي] إيثانول) إلى كل عينة بتركيز نهائي قدره 1٪. تخلط عن طريق سحب العينات.
5. لحطام خلايا الحبيبات ، عينات أجهزة الطرد المركزي عند 13,500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل جميع المحللات الصوتية (الطافي) من كل عينة إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مل.
6. خذ 30 ميكرولتر من المحللة الصوتية من كل عينة (~ 3 ٪ من المحللة الموبعة) وأضفها إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مل للتحقق من الصوتنة. قم بتخزين المحللات الصوتية المتبقية عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للحضانة باستخدام حبات مغلفة بالأجسام المضادة.

< ص الفئة = "jove_title" >4. التحقق من الصوتنة

1. اصنع 20 مل من 2x بروتيناز K العازلة عن طريق إضافة 2 مل من 0.5 M Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) ، 2 مل من 0.5 M حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) ، 10 مل من 10٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) و 6 مل من DDH₂O. لا تقم بإضافة CPI إلى هذا المخزن المؤقت. يحفظ في أنبوب سعة 50 مل في RT.
2. لعكس الارتباط المتقاطع بين البروتين والحمض النووي ، عن طريق إزالة البروتينات ، خذ 30 ميكرولتر من الكروماتين الموبعة صوتنة من كل عينة (من الخطوة 3.6) ، أضف 166 ميكرولتر من ddH₂O المعقم ، و 200 ميكرولتر من 2x بروتيناز K و 4 ميكرولتر من 20 مجم / مل بروتيناز K. دوامة العينات لفترة وجيزة ، ثم احتضانها عند 65 درجة مئوية لمدة 1-3 ساعة عند 24 × جم.
3. ملاحظة: يمكن أن تكون الأحللة الصوتية متشابكة عكسية عند 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
4. استخراج الحمض النووي باستخدام الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل (PCIA: 25: 24: 1) وطريقة ترسيب الإيثانول على النحو التالي.
   أنذر: PCIA سامة. استخدمه تحت غطاء الدخان مع معدات الحماية الشخصية القياسية (PPE).
   1. أضف 400 ميكرولتر من PCIA إلى كل عينة في أنابيب سعة 1.5 مل ، واضبط الدوامة على السرعة القصوى وعينات الدوامة لمدة 20 ثانية. سيتم ملاحظة مرحلتين. انقل بعناية الطبقة المائية العليا (المرحلة الواضحة) لكل عينة إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مل.
   2. أضف 1 ميكرولتر من 10 مجم / مل RNase A. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   3. أضف 1 ميكرولتر من 20 مجم / مل من الجليكوجين إلى كل عينة ، ثم قم بترسيب 1 مل من الإيثانول المثلج 100٪ (المخزن في فريزر -20 درجة مئوية). تخلط لفترة وجيزة ، ثم تحتضن العينات في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 18,400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتسكب بعناية 100٪ من الإيثانول.
   4. اغسل الكريات ب 500 ميكرولتر من الإيثانول المثلج 70٪ (مخزن في فريزر -20 درجة مئوية). جهاز طرد مركزي عند 18,400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   5. احتضان العينات في أنابيب سعة 1.5 مل عند 50 درجة مئوية حتى يتبخر الإيثانول المتبقي. أعد تعليق كريات الحمض النووي في 15 ميكرولتر من ddH2O المعقمة أو ddH2O الخالي من النوكلياز.
   6. قم بتشغيل عينات الحمض النووي المستخرجة ، جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي ، في هلام الاغاروز بنسبة 1.5٪ عند 120-180 فولت وتحقق من حجم الحمض النووي الصوتي.

فئة

5. حضانة الأجسام المضادة بالخرز

ملاحظة: الخطوات التالية في هذا البروتوكول هي ما يقرب من 2 × 10⁷ خلايا عصبية متمايزة عن خلايا ES للفأر. لا تقم بتجميد وذوبان الخرزات المغناطيسية في أي وقت أثناء بروتوكول ChIP-exo لأن الخرزات قد تتشقق مما يتسبب في تلوث العينة أو قد يتعرض أداء الجسم المضاد للخطر.

1. بعد تحلل الخلية والصوتنة ، قم بإعداد الخرز المغناطيسي للبروتين G (جدول المواد) ل ChIP ، واخلط الخرز المغناطيسي حتى يتجانس ، ثم أضف 25 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى 2 مل من أنابيب البروتين منخفضة ><الارتباط. ملاحظة: يعتمد نوع الخرزات المغناطيسية المستخدمة على أنواع الأجسام المضادة.
2. اغسل الخرزات ب 1 مل من محلول المنع (الجدول 1) ، واخلطها جيدا ، ثم ضعها على رف مغناطيسي لمدة 1 دقيقة. بينما لا تزال على رف مغناطيسي ، قم بإزالة المادة الطافية بمجرد أن تصبح صافية.
3. أضف 1 مل من محلول الحجب إلى الخرز المغناطيسي. أنابيب صخرية لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية على منصة هزازة. قم بالدوران لفترة وجيزة ، ثم ضع الأنابيب على رف مغناطيسي وقم بإزالة المادة الطافية.
4. كرر الخطوة 5.3 مرتين أخريين.
5. أضف 500 ميكرولتر من محلول الحجب إلى الخرز المغناطيسي. قم بتدوير الجسم المضاد لفترة وجيزة ضد Isl1 (0.04 ميكروغرام / ميكرولتر ، جدول المواد) ، ثم أضف 4 ميكروغرام من الجسم المضاد إلى أنابيب البروتين المنخفضة الارتباط المقابلة 2 مل التي تحتوي على الخرز المغناطيسي في محلول الحظر.
6. كرر الخطوة 5.5 بدون جسم مضاد (أي عدم وجود جسم مضاد للتحكم في ChIP).
   ملاحظه: يمكن تحديد كمية الجسم المضاد المراد إضافتها تجريبيا من خلال النظر في جودة الجسم المضاد وعدد الخلايا المستخدمة في ChIP.
7. عينات من الصخور عند 4 درجات مئوية لمدة 6-24 ساعة على منصة هزازة.

فئة

6. ترسيب الكروماتين المناعي (ChIP)

1. اغسل الخرزات المغلفة بالأجسام المضادة من الخطوة 5.8 ب 1 مل من محلول الحظر. ضع العينات على منصة هزاز عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
2. كرر الخطوة 6.1 مرتين أخريين.
3. أعد تعليق الخرز المطلي بالأجسام المضادة في 50 ميكرولتر من محلول المنع ، ثم انقلها إلى أنابيب جديدة منخفضة الارتباط بالبروتين سعة 2 مل. لكل عينة من عينات ChIP ، أضف محللات صوتنة (~ 1.0 مل من الخطوة 3.6) إلى حبات مغلفة بالأجسام المضادة في أنابيب منخفضة الارتباط بالبروتين سعة 2 مل.
4. احتضان كل عينة على منصة هزازة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

فئة

7. يغسل ChIP

ملاحظة: احتفظ بالعينات على الجليد أو عند 4 درجات مئوية للحفاظ على تشابك البروتين والحمض النووي أثناء غسل ChIP.

1. اصنع عازلة غسيل عالية الملح ، ومخزن غسيل LiCl و 10 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 7.4) كما هو موضح في الجدول 2. يخزن في أنابيب سعة 50 مل عند 4 درجات مئوية. أضف 50 ميكرولتر من مخزون 1000x CPI إلى جميع المخازن قبل الاستخدام مباشرة.
قم
2. بتدوير العينات لفترة وجيزة في أنابيب منخفضة الارتباط بالبروتين سعة 2 مل لتجميع السائل من الأغطية ، ثم ضعها على رف مغناطيسي لمدة 1 دقيقة وقم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة.
3. لغسل ChIP ، أضف 1 مل من محلول التحلل 3 (عند 4 درجات مئوية) إلى كل أنبوب. تخلط على منصة هزازة على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. قم بتدوير العينات لفترة وجيزة ، ثم ضعها على رف مغناطيسي لمدة 1 دقيقة وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة.
4. أضف 1 مل من محلول الغسيل البارد عالي الملح إلى كل أنبوب. تخلط على منصة هزازة على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. قم بتدوير العينات لفترة وجيزة ، ثم ضعها على رف مغناطيسي لمدة 1 دقيقة وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة.
5. أضف 1 مل من محلول غسيل LiCl البارد إلى كل أنبوب. تخلط على منصة هزازة على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. قم بتدوير العينات لفترة وجيزة ، ثم ضعها على رف مغناطيسي لمدة 1 دقيقة وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة.
6. أضف 1 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl البارد 10 ملي (الرقم الهيدروجيني 7.4) إلى كل أنبوب. تخلط على منصة هزازة على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. قم بتدوير العينات لفترة وجيزة ، ثم ضعها على رف مغناطيسي لمدة 1 دقيقة وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة.
   ملاحظه: يمكن استخدام المخزن المؤقت Tris-EDTA (درجة الحموضة 8.0) بدلا من المخزن المؤقت Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4).

الجدول 1: وصفات لمخازن التحلل 1-3 والمخزن المؤقت للحظر. يحفظ في أنابيب سعة 50 مل عند 4 درجات مئوية. أضف 50 ميكرولتر من مخزون CPI (مثبط إنزيم البروتينات الكامل) 1000x إلى جميع المخازن قبل الاستخدام مباشرة.

المخزن المؤقت للتحلل 1 الكاشف الحجم (مل) [نهائي] 1 م هيبس (درجة الحموضة 7.3) 2.5 50 ملم 5 م كلوريد الصوديوم 1.4 140 ملم 0.5 م EDTA (درجة الحموضة 8.0) 0.1 1 ملي متر 50٪ جلسرين 10 10٪ 10٪ أوكتيل فينول إيثوكسيلات 2.5 0.50٪ 10٪ 2- [4- (2،4،4-trimethylpentan-2-yl) فينوكسي] إيثانول 1.25 0.25٪ معقم ddH₂O تعبئة حتى 50 المخزن المؤقت للتحلل 2 الكاشف الحجم (مل) [نهائي] 0.5 م Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) 1 10 ملم 5 م كلوريد الصوديوم 2 200 ملم 0.5 م EDTA (درجة الحموضة 8.0) 0.1 1 ملي متر معقم ddH₂O تعبئة حتى 50 المخزن المؤقت للتحلل 3 الكاشف الحجم (مل) [نهائي] 1 م تريس حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.0) 0.5 10 ملم 5 م كلوريد الصوديوم 1 100 ملم 0.5 م EDTA (درجة الحموضة 8.0) 0.1 1 ملي متر 10٪ حمض ديوكسيكوليك 0.5 0.10٪ 30٪ محلول ملح الصوديوم N-Lauroylsarcosine 0.83 دولار 0.50٪ معقم ddH₂O تعبئة حتى 50 حجب الحل الكاشف مبلغ [نهائي] ألبومين مصل الأبقار (BSA) 250 مجم 0.50٪ مثبط البروتياز الكامل (CPI، 1000x) 50 ميكرولتر 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) املأ حتى 50 مل

الجدول 2: وصفات لغسل ChIP: عازلة غسيل عالية الملح ، مخزن مؤقت LiCl Wash و 10 ملي مولار مخزن مؤقت Tris-HCl (درجة الحموضة 7.4). يخزن في أنابيب سعة 50 مل عند 4 درجات مئوية. أضف 50 ميكرولتر من مخزون 1000x CPI إلى جميع المخازن قبل الاستخدام مباشرة.

عازلة غسيل عالية الملح الكاشف الحجم (مل) [نهائي] 1 م هيبس (درجة الحموضة 7.3) 2.5 50 ملم 5 م كلوريد الصوديوم 5 500 ملم 0.5 م EDTA (درجة الحموضة 8.0) 0.1 1 ملي متر 10٪ 2- [4- (2،4،4-trimethylpentan-2-yl) فينوكسي] إيثانول 5 1٪ 5٪ حمض ديوكسيكوليك 1 0.10٪ 5٪ SDS 1 0.10٪ معقم ddH₂O تعبئة حتى 50 LiCl المخزن المؤقت للغسيل الكاشف الحجم (مل) [نهائي] 0.5 م Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) 2 20 ملم 0.5 م EDTA (درجة الحموضة 8.0) 0.1 1 ملي متر 1 م LiCl 12.5 250 ملم 10٪ أوكتيل فينول إيثوكسيلات 2.5 0.50٪ 5٪ حمض ديوكسيكوليك 5 0.50٪ معقم ddH₂O تعبئة حتى 50 10 ملي مولار المخزن المؤقت Tris-HCl الكاشف الحجم (مل) [نهائي] 1 م تريس حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.4) 0.5 10 ملم معقم ddH₂O تعبئة حتى 50

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Agarose ، UltraPure إنفيتروجين 16500 فحص صوتية (القسم 4.3.6) الألبومين، مصل البقر (BSA)، خال من البروتينيز، عزل الصدمات الحرارية، 98٪ على الأقل بيو شوب ألب 003 حل الحجب الجسم المضاد ضد Isl1 دي إس إتش بي 39.3F7 تحرسان الأجسام المضادة بالخرز (القسم 5.6) بيوروبتور بيكو دياجينود B01060010 صوتنة الكروماتين (القسم 3.3) جهاز طرد مركزي 5424 R إيبندورف 5404000138 صوتنة الكروماتين (القسم 3.5) ، فحص صوتنة (القسم 4.3.1 و 4.3.3 و 4.3.4) جهاز طرد مركزي 5804 R إيبندورف 22623508 حصاد الخلايا والربط المتقاطع والتجميد (القسم 1.3) ، تحلل الخلايا (القسم 2.2 و 2.3) ، صوتنة الكروماتين (القسم 3.1) كوكتيل مثبط البروتياز الكامل الخالي من EDTA روش 4693159001 تمت إضافته إلى جميع المخازن المؤقتة ، باستثناء المخزن المؤقت Proteinase K و ChIP Elution buffer ملح الصوديوم بحمض ديوكسيكوليك فيشر علمي ص349 عازلة التحلل 3 ، عازلة غسيل عالية الملح ومخزن غسيل LiCl EDTA، 0.5 م، محلول معقم، درجة الحموضة 8.0 بيو شوب EDT111 المخزن المؤقت للتحلل 1-3 ، فحص صوتنة (القسم 4.1) ، المخزن المؤقت لغسل الملح العالي ، المخزن المؤقت لغسيل LiCl ومخزن الوخزة المضاربة ChIP الكحول الإيثيلي اللامائي ، 100٪ الكحوليات التجارية P006EAAN فحص صوتية (القسم 4.3.3) الفورمالديهايد ، 36.5-38٪ ، يحتوي على 10-15٪ ميثانول سيغما F8775 حصاد الخلايا والربط المتقاطع والتجميد (القسم 1.1) الجلسرين ، درجة الكاشف ، 99.5٪ كحد أدنى بيو شوب GLY002 عازلة التحلل 1 جلايسين، درجة التكنولوجيا الحيوية، 99٪ على الأقل بيو شوب GLN001 خلايا الحصاد والربط المتبادل والتجميد (القسم 1.2) الجليكوجين ، درجة الحمض النووي الريبي الترمو: العلمية R0551 فحص صوتية (القسم 4.3.3) HEPES ، محلول معقم مفلتر 1 متر ، درجة الحموضة 7.3 بيو شوب هيب 003 عازلة التحلل 1 ، عازلة غسيل عالية الملح كلوريد الليثيوم (LiCl) ، درجة الكاشف بيوشوب إضاءة704 LiCl غسل العازلة الخرز المغناطيسي ل ChIP (Dynabeads Protein G) Dynabeads Protein G (حبات مغناطيسية ل ChIP) Dynabeads Protein G (حبات مغناطيسية ل ChIP) حضانة الأجسام المضادة بالخرز (القسم 5) رف مغناطيسي (مغناطيس DynaMag-2) إنفيتروجين 12321 د تستخدم في العديد من الخطوات في الأقسام: 5 محلول ملح الصوديوم N-Lauroylsarcosine ، محلول مائي 30٪ ، ≥97.0٪ (HPLC) سيغما 61747 [م] عازلة التحلل 3 أوكتيل فينول إيثوكسيلات (إيجيبال CA630) بيو شوب غير 999 Lysis Buffer 1 و LiCl Wash Buffer الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل ، درجة التكنولوجيا الحيوية (25: 24: 1) بيو شوب رقم التعريف الشخصي 512 التحقق من صوتنة (القسم 4.3.1) محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، 1x كورنينج 21040 سي في خلايا الحصاد والربط المتقاطع والتجميد (القسم 1.3) وصوتنة الكروماتين (القسم 3.1) ، تحرس الأجسام المضادة بالخرز (القسم 5.1) مزود الطاقة الأساسي PowerPac بيورراد 1645050 فحص صوتية (القسم 4.3.6) محلول البروتيناز K ، درجة الحمض النووي الريبي إنفيتروجين 25530049 التحقق من صوتية (القسم 4.2) خالي من Rnase A و Dnase و Protease الترمو: العلمية البريد الإلكتروني: EN0531 فحص صوتية (القسم 4.3.2) كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) ، الكاشف الحيوي سيغما S5886 عازلة التحلل 1-3 ، عازلة غسيل عالية الملح كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، درجة الرحلان الكهربائي بيو شوب SDS001 فحص صوتنة (القسم 4.1) ، عازلة غسيل عالية الملح ومخزن مؤقت شطف ChIP حبات صوتنة وأنابيب Bioruptor سعة 15 مل دياجينود C01020031 صوتنة الكروماتين (القسم 3.1 و 3.2) خلاط حراري F1.5 إيبندورف 5384000020 الأقسام 4.2 و 4.3.2 و 4.3.5 محلول هيدروكلوريد Trizma (Tris-HCl) ، معتمد من BioPerformance ، 1 متر ، درجة الحموضة 7.4 سيغما تي 2194 10 ملي مولار Tris-HCl عازلة محلول تريزما هيدروكلوريد (Tris-HCl)، معتمد من الأداء الحيوي، 1 متر، درجة الحموضة 8.0 سيغما تي 2694 المخزن المؤقت للتحلل 2 ، المخزن المؤقت للتحلل 3 ، فحص صوتنة (القسم 4.1) ، مخزن الغسيل LiCl ومخزن الحذف ChIP VWR Mini Tube Rocker ، متغير السرعة VWR 10159-752 تستخدم في العديد من الخطوات في الأقسام: 1 و 2 و 5 و 6 و 7 2- [4- (2،4،4-trimethylpentan-2-yl) الفينوكسي] الإيثانول ، تريتون X-100 ، درجة الكاشف بيو شوب TRX506 عازلة التحلل 1 ، الكروماتين الصوتي (القسم 3.4) ومحلول غسيل عالي الملح