< p class = "jove_title" >
1. تلبيخ مناعي للشرائح العضوية
- ضع شرائح المجهر التي تحتوي على أقسام عضوية في وعاء تكتل به 50 مل من 1x PBS الدافئ مسبقا ، مع استيعاب ما يصل إلى 10 شرائح متتالية.
ملاحظه: يجب غمر جميع الأقسام العضوية في السائل.
- احتضن لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية لإزالة الشرائح من الجلاطة.
- اغسل 1x مع 50 مل من 1× PBS لمدة 5 دقائق في RT: انقل الشرائح إلى وعاء تكتل يحتوي على 1× PBS طازج.
- انقل الشرائح إلى وعاء يحتوي على 50 مل من الجلايسين الطازج (الجدول 1) واحتضنه لمدة 10 دقائق في RT.
- انقل الشرائح إلى وعاء تكتل يحتوي على 50 مل من 0.1٪ تريتون (الجدول 1) وتخلل لمدة 10 دقائق في RT.
- يغسل ب 1× PBS لمدة 5 دقائق 2x.
- تحضير طبق التلوين المناعي بورق 3 مم مبلل في 1× PBS. جفف الشرائح بمنديل حول الشرائح وضعها على ورق 3 مم. باستخدام ماصة باستور، قم بتغطية سطح الشرائح بالكامل بمحلول مانع (الجدول 1)، 0.5 مل لكل شريحة. احتضن لمدة 30 دقيقة في RT.
- قم بإزالة محلول الانسداد الزائد وجفف الشرائح بمنديل حول الشرائح. ضع 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي (الجدول 2) المخفف في محلول مانع فوق الأقسام وقم بتغطيته بالغطاء. ضع الشرائح في طبق تلطيخ مناعي معد مسبقا. احتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- انقل الشرائح إلى وعاء تأقلم مع 50 مل من TBST (الجدول 1) ، واترك الأغطية تسقط ، واغسلها باستخدام TBST لمدة 5 دقائق و 3x.
- ضع 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف في محلول مانع فوق الأقسام وقم بتغطيته بالغطاء. ضع الشرائح في طبق التلوين المناعي المعد مسبقا. احتضن لمدة 30 دقيقة في RT ، محمي من الضوء.
- انقل الشرائح إلى وعاء التقطيع مرة أخرى واغسلها ب 50 مل من TBST لمدة 5 دقائق و 3 مرات.
- جفف الشرائح بالمناديل الورقية حول الشرائح وضع الشرائح في طبق تلطيخ مناعي معد مسبقا. باستخدام ماصة باستور، أضف 0.5 مل من محلول DAPI على سطح الشرائح بالكامل. احتضن لمدة 5 دقائق في RT.
- كرر الخطوة 1.9.
- جفف الشرائح بعناية بمنديل. أضف 50 ميكرولتر من متوسط التركيب قطرة قطرة على طول الشريحة ثم قم بخفض الغطاء بعناية على كل شريحة ، وثنيه قليلا لتجنب الفقاعات.
< p class = "jove_content" >
الجدول 1: حلول لتحضير العضيات للاستئصال بالتبريد والتلوين المناعي. المدرجة هي جميع المكونات والأحجام المستخدمة لتحضير المحاليل المستخدمة في تحضير العضيات للاستئصال بالتبريد والتلوين المناعي.
الجيلاتين / السكروز
التركيز النهائي: 7.5٪ / 15٪ وزن / وزن
1. يزن 15 جم من السكروز و 7.5 جم من الجيلاتين في زجاجة زجاجية معقمة من Schott ويخلط جيدا
2. قم بتسخين PBS 1x مسبقا عند 65 درجة مئوية
3. أضف PBS الدافئ مسبقا 1x إلى الوزن النهائي البالغ 100 جم واخلطه جيدا
4. ضع زجاجة Schott الزجاجية في لوح تسخين على حرارة 65 درجة مئوية ورجيها حتى يذوب الجيلاتين
5. احتضان عند 37 درجة مئوية حتى يستقر المحلول
جلايسين < br / >
التركيز النهائي: 0.1 م
أضف 0.37 جم جلايسين إلى 50 مل من PBS 1x المحضر حديثا.
حل تريتون
التركيز النهائي: 0.1٪ وزن / حجم
1. قم بإعداد مخزون Triton X-100 بنسبة 10٪: 5 جم من Triton X-100 في 50 مل من PBS 1x
2. أضف 0.5 مل من مخزون Triton X-100 إلى 50 مل من PBS 1x.
TBST
20 ملي مولار Tris-HCl درجة الحموضة 8.0 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.05٪ وزن / حجم Tween-20
20 مل تريس 1 م
30 مل كلوريد الصوديوم 5 م < / >
5 مل Tween-20 (10٪ مخزون: 5 جم من Tween-20 في 50 مل من الماء)
املأ حتى 1 لتر بالماء.
حل الحجب
يضاف 5 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS، التركيز النهائي: 10٪ من حجم الجنين) إلى 50 مل من TBST.
حل DAPI
أضف 15 ميكرولتر من محلول مخزون DAPI (1 مجم / مل) إلى 10 مل من الماء المقطر
مويول
1. أضف 2.4 جم من Mowiol إلى 6 جم من الجلسرين ورجه لمدة ساعة واحدة في طبق مسخن مسبقا عند 50 درجة مئوية
2. أضف 6 مل من الماء المقطر ورجه لمدة 2 ساعة
3. أضف 12 مل من تريس 200 ملي مولار (درجة الحموضة 8.5) ورجه لمدة 10 دقائق < / >
4. جهاز طرد مركزي عند 5,000 × جم لمدة 15 دقيقة 5. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.
< p class = "jove_content" >
الجدول 2: الأجسام المضادة الأولية. يتم سرد الأجسام المضادة الأولية والاستنساخ والتخفيفات المحسنة المستخدمة في التلوين المناعي.
جسم
الأنواع المضيفة
التخفيف
بارل 1
أرنب
1/500
كالبيندين
أرنب
1/500
الخريطة 2
فأر
1/1000
ن-كاديرين
فأر
1/1000
نيستين
فأر
1/400
أوليغ 2
أرنب
1/500
PAX6
أرنب
1/400
SOX2
فأر
1/200
TBR1
أرنب
1/200
TBR2
أرنب
1/200
TUJ1
فأر
1/1000
