تطوير نموذج في المختبر لعدوى فيروس زيكا في العضيات الدماغية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Salick، M. R.، et al. نمذجة عدوى فيروس زيكا في الدماغ البشري النامي في المختبر باستخدام العضيات الدماغية المشتقة من الخلايا الجذعية. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو إنشاء نموذج في المختبر لعدوى فيروس زيكا في الدماغ النامي. العضيات الدماغية البشرية التي تحتوي على وريدات من الخلايا الجذعية والخلايا السلفية العصبية (NPCs) والخلايا العصبية مصابة بفيروس زيكا. يصيب الفيروس الشخصيات غير القابلة للعب ويؤدي إلى موت الخلايا المبرمج ، مما يعطل نمو العضوية.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title" >1. إنشاء العضيات الدماغية من ثقافة iPSC / hESC 2D (اليوم 0)

ملاحظة: يفترض هذا البروتوكول أن صيانة الخلايا الجذعية (SC) تتم في وسائط صيانة الخلايا الجذعية الخالية من xeno (SCMM) مع ركيزة فيترونكتين أو Geltrex. في حالة استخدام وسائط بديلة لزراعة الخلايا الجذعية عالية البروتين ، فمن المستحسن نقل ثقافات SCM إلى SCMM لمقطعين على الأقل قبل البدء في تكوين العضوية. لم يتم اختبار البروتوكول باستخدام طرق زراعة SC القائمة على التغذية.

1. باستخدام طرق الصيانة المنتظمة ل SC ، اجعل المزارع تصل إلى التقاء 50٪ -70٪. عادة ما يكون هذا بعد 3-4 أيام من المرور ، على الرغم من أن هذا يمكن أن يعتمد على طريقة الثقافة وخط الخلية.
   ملاحظه: هناك حاجة إلى ما يقرب من 2 بئر من صفيحة 6 آبار لإنتاج صفيحة كاملة من 96 بئرا من العضيات.
2. افحص الثقافات عبر الفحص المجهري للحقل الساطع بتكبير 10X-20X لضمان مورفولوجيا المستعمرة الصحية ، دون أي تمايز يمكن اكتشافه.
3. قم بإحضار SCMM إلى 37 درجة مئوية في حمام ماء ساخن وإذابة قارورة سعة 50 ميكرولتر من 50 ملي مولار Y-27632 (مثبط الصخور) و 2 مل من كاشف الانفصال الأنزيمي إلى درجة حرارة الغرفة.
4. قم بإعداد لوحة بئر U-bottom 96 ذات صلة منخفضة للغاية (ULA) وماصة P200 متعددة القنوات وخزان كاشف سعة 25 مل.
5. Aliquot 45 مل من SCMM في أنبوب مخروطي 50 مل وإضافة 45 ميكرولتر من 50 ملي Y-27632. تخلط جيدا عن طريق الترتيب.
6. قم بشفط الآئرين اللذين يحتويان على SCs بالتفريغ ، وأضف بسرعة 1 مل من كاشف الانفصال الخالي من الإنزيم إلى كل بئر باستخدام ماصة P1000. احتضان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
7. قم بشفط الآبار المعالجة بالتفريغ وأضف 1 مل من كاشف الانفصال الأنزيمي إلى كل بئر باستخدام ماصة P1000.
   1. احتضن الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق إضافية.
   2. قم بإزالة اللوحة وفحص الآبار المعالجة. اضغط برفق على اللوحة لتفكيك الخلايا المجمعة. إذا كانت مجموعات الخلايا الكبيرة لا تزال مرئية ، فقم باحتضان اللوحة لمدة دقيقتين إضافيتين عند 37 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة حتى تختفي العناقيد بالعين المجردة.
8. بمجرد تفكك الخلايا بشكل صحيح ، أضف 1 مل من SCMM إلى كل بئر لتعطيل إنزيمات التفكك. قم بتجميع 4 مل من تعليق الخلية في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وخذ كمية صغيرة لعد الخلايا.
   1. أعد أي آبار متبقية غير معالجة في لوحة الصيانة إلى حاضنة 37 درجة مئوية.
9. أثناء العد ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
10. حدد العدد الإجمالي للخلايا واحسب كمية محلول SCMM + Y-27632 الذي سيكون مطلوبا لتحقيق تعليق 60,000 خلية / مل.
11. قم بشفط المادة الطافية بعناية وأضف الحجم المحسوب لمحلول SCMM + Y-27632. امزج 5-10 مرات باستخدام ماصة سعة 5 مل ، مما يضمن تعليق خلية موحد.
12. انقل تعليق الخلية على الفور إلى خزان كاشف، وقم بإدخال ماصة 150 ميكرولتر في كل بئر من لوحة ULA U-bottom المكونة من 96 بئرا باستخدام ماصة P200 متعددة القنوات. ينتج هذا 96 عضوا فرديا ، يتكون كل منها في البداية من 9000 خلية.
13. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 150 × جم لمدة 1 دقيقة.
14. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية ، ولا تزعج اللوحة لمدة 48 ساعة.

< p class = "jove_title" >2. صيانة العضوية الدماغية (اليوم 2)

1. قم بإعداد 17 مل من SCMM مع 17 ميكرولتر من 50 ملي مولار Y-27643 في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. قم بتسخين محلول SCMM + Y-27632 إلى 37 درجة مئوية في حمام ماء ساخن.
2. خذ الصفيحة العضوية من الحاضنة وباستخدام ماصة P200 متعددة القنوات مضبوطة على 75 ميكرولتر، ارسم الوسط ببطء من حافة البئر في الصف الأول. بمجرد سحب الوسيط ، طرد الوسط بسرعة مرة أخرى إلى البئر لرفع الخلايا السائبة والعضيات. كرر هذا لكل صف.
   ملاحظه: هذه التقنية ، المشار إليها فيما يلي باسم "التشتت" ، ترفع الحطام الخلوي والعضوية في التعليق. تغرق العضوية بسرعة في قاع البئر ، بينما يظل الحطام الأصغر معلقا ، مما يسمح بإزالته مع تغيير الوسائط. هذا يساعد على منع العضوية من الراحة في الحطام الخلوي أثناء الاستزراع.
   1. بعد تشتيت جميع الآبار ، انتظر لمدة 15 ثانية للتأكد من أن العضيات قد غرقت في قاع كل بئر.
3. استنشق ببطء وبعناية 75 ميكرولتر من الوسط من كل بئر باستخدام ماصة P200 متعددة القنوات وقم بتوزيعها في خزان النفايات.
   ملاحظه: يستنشق معظم المستخدمين أحيانا عضوا أثناء الرضاعة المنتظمة. يمكن أن يحدث هذا حوالي 1٪ من الوقت. يرجى التخطيط وفقا لذلك لضمان بقاء عدد كاف من العضيات على قيد الحياة في النقاط الزمنية التجريبية.
4. انقل محلول SCMM + Y-27632 إلى خزان كاشف وقم بتوزيع 150 ميكرولتر في كل بئر عضوي باستخدام ماصة P200 متعددة القنوات.
5. ضع الطبق مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >3. صيانة العضوية الدماغية (اليوم 3)

1. دافئ 17 مل من SCMM إلى 37 درجة مئوية ، هذه المرة بدون Y-27643.
2. مع ضبط ماصة P200 متعددة القنوات على 100 ميكرولتر، قم بتفريق جميع آبار الصفيحة العضوية (انظر الخطوة 2.2). انتظر 15 ثانية للتأكد من أن العضيات قد غرقت في قاع آبارها.
3. قم بإعداد خزان النفايات ونقل SCMM الدافئ إلى خزان المصدر.
قم
4. بسحب 125 ميكرولتر من الوسط بعناية من كل بئر واستبدلها ب 150 ميكرولتر من SCMM الطازجة باستخدام ماصة P200 متعددة القنوات.
5. ضع الطبق مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية.

فئة

4. صيانة العضوية الدماغية (اليوم 4+)

ملاحظة: قم بإجراء هذه الصيانة الدورية كل يومين حتى الإصابة.

1. قبل البدء في التغذية في اليوم 4 ، قم بإعداد وسيط الحث العصبي (NI).
   1. قم بإذابة 250 ميكرولتر من 2 مجم / مل من الهيبارين ، جنبا إلى جنب مع قارورة واحدة سعة 5 مل من مكمل 100X N-2. أضف 250 ميكرولتر من الهيبارين ، و 5 مل من 100X N-2 ، و 5 مل من 100X الحد الأدنى من الأحماض الأمينية الأساسية المتوسطة غير الأساسية (MEM-NEAA) إلى 500 مل من خليط النسر المتوسط / المغذيات المعدل من Dulbecco F-12 (DMEM / F12) + GlutaMAX. قم بتصفية معقمة للمحلول المختلط في مرشح سعة 500 مل.
      ملاحظة: احتفظ ب NI عند 4 درجات مئوية عندما لا تكون قيد الاستخدام ؛ يستمر NI لمدة تصل إلى أسبوعين قبل تحضير وسط طازج.
2. دافئ 17 مل من NI متوسط إلى 37 درجة مئوية.
3. مع ضبط ماصة P200 متعددة القنوات على 100 ميكرولتر، قم بتفريق جميع آبار الصفيحة العضوية (انظر الخطوة 2.2). انتظر 15 ثانية للتأكد من أن العضيات قد غرقت في قاع آبارها.
4. قم بإعداد خزان النفايات ونقل NI الدافئ إلى خزان مصدر.
قم
5. بسحب 125 ميكرولتر من الوسط بعناية من كل بئر واستبدلها ب 125 ميكرولتر من NI الطازج باستخدام ماصة P200 متعددة القنوات.
6. ضع الطبق مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >5. العدوى العضوية بفيروس زيكا (ZIKV) (~ اليوم 24)

ملاحظة: بعد حوالي 3 أسابيع من التمايز ، ستكون هناك هياكل ظهارية عصبية كبيرة وريدات مرئية داخل العضوية والتي ستكون شديدة التأثر بعدوى ZIKV.

1. أحضر محلول الملح المتوازن 1X من إيرل (EBSS) ، و 1X محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، و NI إلى 37 درجة مئوية في حمام الماء الساخن.
2. تمييع ZIKV بتركيز معروف في 1X EBSS إلى تعدد العدوى المستهدف (MOI).
   ملاحظه: يوصى بمعايرة عمليات المعايرة بمختلف عمليات المعايرة لتحقيق استجابة جرعة فيروسية. قد يختلف هذا حسب سلالة الفيروس. بالنسبة إلى ATCC VR-1838 و ATCC VR-1843 ، تتراوح قيم وزارة الداخلية النموذجية بين 0.1 و 10).
3. قم بإزالة جميع الوسائط بعناية من البئر العضوي باستخدام ماصة P200 أحادية القناة. أضف بسرعة 200 ميكرولتر من 1X PBS إلى كل بئر باستخدام ماصة P200 متعددة القنوات لغسل العضيات.
4. قم بإزالة جميع الوسائط بعناية من البئر العضوي باستخدام ماصة P200 أحادية القناة. أضف بسرعة 50 ميكرولتر من محلول فيروس 1X EBSS فقط (عدوى وهمية) أو ZIKV جيدا وتأكد من غمر العضوي بالكامل. كرر مع كل عضوية سيتم إصابتها بالعدوى للدراسة.
5. ضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة < / > ملاحظه: لا ينبغي أن يؤثر احتضان العضيات المصابة بالوهمية لهذه المدة بشكل كبير على نموها مقارنة بالعضيات غير المضطربة.
6. قبل اكتمال الحضانة الفيروسية بحوالي 30 دقيقة ، قم بتناول 25 مل من NI في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وتصل إلى 37 درجة مئوية في حمام الماء الساخن.
7. بعد اكتمال التعرض الفيروسي ، اغسل العضيات ب 200 ميكرولتر من 1X PBS لكل بئر ، واترك العضيات تستقر لمدة 15 ثانية ، ثم قم بإزالة 1X PBS باستخدام ماصة P200 أحادية القناة.
8. أضف 200 ميكرولتر من NI الطازج إلى كل بئر ، ثم ضعه مرة أخرى في الحاضنة.
   1. اختياري: لمدة يوم 0 نقطة زمنية ، يمكن تصوير العضيات بعد ساعة واحدة من الإصابة.
9. استمر في الاستزراع عن طريق استبدال 125 ميكرولتر NI كل يومين باستخدام طريقة التشتت (انظر الخطوة 4). تأكد من التخلص بشكل صحيح من الوسائط والنصائح المستهلكة ، حيث تحتوي على جزيئات ZIKV المعدية.

المواد