تقييم صلاحية الخلايا العصبية في ثقافة الخلايا العصبية المخيخية عن طريق التلوين المزدوج

الملخص

المصدر: Jiajia, L., et al. تقييم صلاحية الخلايا العصبية باستخدام تلطيخ ثنائي الأسيتات البروبيديوم يوديد الفلوريسين في ثقافة الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو طريقة تحديد الخلايا العصبية من مزرعة مختلطة من الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية والخلايا الدبقية باستخدام تلطيخ مزدوج مع ثنائي أسيتات الفلوريسين (FDA) ويوديد البروبيديوم (PI) ، حيث تظهر الخلايا العصبية الحية باللون الأخضر وتظهر الخلايا العصبية الميتة باللون الأحمر.

البروتوكول

فئة < p = "jove_title" >1. تلطيخ مزدوج FDA-PI وفي ثقافة الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية (CGN)

1. تحضير محلول عمل ثنائي أسيتات بروبيديوم يوديد الفلوريسين (FDA-PI) عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من محلول مخزون إدارة الغذاء والدواء (التركيز النهائي: 10 ميكروغرام / مل) و 50 ميكرولتر من محلول مخزون PI (التركيز النهائي: 50 ميكروغرام / مل) في 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). امزجها عن طريق الدوامة وضعها على الثلج.
   ملاحظه: قم بإعداد حل عمل FDA-PI حديثا قبل الاستخدام مباشرة.
2. أخرج لوحة زراعة الخلية من الحاضنة. ضعه على الجليد.
3. استنشق وسط الثقافة واستبدله ب PBS.
   البارد ملاحظه: يجب أن يتم تغيير الحل ببطء وبعناية. تجنب لمس الخلايا بأطراف الماصة.
4. قم بشفط PBS البارد واستبدله ب FDA-PI البارد (500 ميكرولتر / بئر لألواح زراعة الخلايا المكونة من 12 بئر أو 1 مل / بئر لألواح زراعة الخلايا المكونة من 6 آبار). اتركيه على الثلج لمدة 5 دقائق.
5. قم بشفط FDA-PI وإضافة PBS بارد (100 ميكرولتر / بئر لألواح زراعة الخلايا المكونة من 12 بئر أو 50 ميكرولتر / بئر لألواح زراعة الخلايا المكونة من 6 آبار).
   ملاحظه: لا ينبغي السماح للخلايا بالجفاف عند التقاط الصور.
6. التقط صورا باستخدام الفحص المجهري الفلوري. استخدم مرشح الإثارة بنطاق تمرير 450-490 نانومتر. كشف انبعاثات التألق ل FDA و PI عند 520 و 620 نانومتر ، على التوالي. في ظل نفس الظروف ، التقط صورة تحت الضوء العادي باستخدام وضع تباين الطور للفحص المجهري الفلوري.
   ملاحظه: التقط الصور في غضون 15 دقيقة بعد FDA-PI. وقت التعرض هو 100-300 مللي ثانية ، والكسب التناظري 2.8x.

< p class = "jove_title" >2. تقييم صلاحية الخلايا العصبية

1. بالنسبة للتلوين المزدوج FDA-PI ، قم بتراكب صور الخلايا المكتشفة بعد التصفية بواسطة مرشحات مضان مختلفة عن طريق سحب الطبقة الإيجابية لإدارة الغذاء والدواء على الطبقة الإيجابية PI في برنامج محرر الرسومات.
   1. اضبط عتامة الطبقة الموجبة لإدارة الغذاء والدواء عن طريق إدخال "50٪" في حقل "التعتيم" في لوحة "الطبقات". ادمج طبقتين بالنقر فوق الزر "دمج مرئي" في قائمة "الطبقة". اضبط تباين الصور المتراكبة عن طريق إدخال "50" في حقل "التباين" ضمن "صورة" | "التعديلات" | "السطوع / التباين." تأكد من عدم وجود خلايا موجبة مزدوجة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) وPI في صور التراكب.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مصل الأبقار الجنينية جيبكو 10099141 FBS عالية الجودة ضرورية للثقافة 100× جلوتامين جيبكو 25030081 100× مضاد حيوي جيبكو 15240062 BME متوسط جيبكو 21010046 ثنائي أسيتات الفلورسين سيغما F7378 يوديد البروبيديوم سيغما ص 4170 الأرانب المضادة للجسم المضاد GAP43 أبكام أب75810 الجسم المضاد للفأر المضاد ل GFAP إشارات الخلية 3670 دولار ماصة باستور فولاك Z310727 احرق الحافة قبل الاستخدام 6 لوحات ثقافة الخلايا برنامج النقاط التجارية Z707759 لوحة ثقافة الخلية عالية الجودة ضرورية للثقافة راووق ميليبور SLGP033RB بيبيت 5 مل إكسيل بيو عال017-0003 بيبيت 10 مل إكسيل بيو عال017-0004 حاضنة CO2 الترمو: العلمية 311 المجهر الفلوري نيكون تي آي إس مرشح مضان ومكعبات إيميشن نيكون B-2A ، G-2A ، UV-2A برنامج الصور نيكون عناصر NIS محرر الرسومات softeware طُوب فوتوشوب CS برنامج معالجة الصور المؤسسه إيمج جيه