تصور الخلايا العصبية لجسم الفطر في أدمغة ذبابة الفاكهة عن طريق التلوين المناعي

الملخص

المصدر: Kelly, S. M., et al. تشريح وتلوين الفلورسنت المناعي لجسم الفطر والخلايا العصبية المستقبلة للضوء في أدمغة ذبابة الفاكهة السوداء البالغة. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا مفصلا للتلطيخ المناعي لتصور عيوب النمط الظاهري في أجسام الفطر لأدمغة ذبابة الفاكهة الطافرة. يتضمن البروتوكول استخدام الأجسام المضادة ضد Fas2 ، وهو بروتين يشارك في التوجيه المحوري الذي يسهل التطور المورفولوجي والوظيفي السليم لجسم الفطر.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إجراء التثبيت والتلوين المناعي الفلوري

1. باستخدام ماصة p200 ، انقل الأدمغة المقطوعة من طبق 9 آبار إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 مل مملوء ب 0.5 مل من 4٪ بارافورمالدهيد مخفف في PTN (0.1 M Sodium Phosphate Buffer Formula 7.2 ، 0.1٪ خافض للتوتر السطحي غير أيوني). يمكن دمج ما لا يقل عن 10-15 دماغا من نفس النمط الجيني في أنبوب واحد للطرد المركزي الدقيق. يتم الانتهاء من جميع الخطوات المتبقية (حتى تركيب الأدمغة على الشرائح) في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 0.5 مل.
   أنذر: يجب التعامل مع بارافورمالدهيد (PFA) في غطاء الدخان. يجب حفظ نفايات PFA والتخلص منها بشكل صحيح. يمكن تقسيم عشرين بالمائة من بارافورمالدهايد الذي تم شراؤه في أمبولات زجاجية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وتخزينها عند -20 درجة مئوية لحين الحاجة.
2. داخل غطاء الدخان ، احتضن الأدمغة في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 20 دقيقة مع تأرجح بطيء السرعة في درجة حرارة الغرفة.
3. بعد التثبيت ، اسمح للأدمغة بالاستقرار في قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق عن طريق الجاذبية.
   ملاحظه: قد تلتصق الأدمغة أحيانا بجانب أنبوب الطرد المركزي الدقيق. إذا حدث هذا ، فمن المفيد عادة تدوير الأنبوب بشكل جانبي بين السبابة والإبهام أو النقر برفق على الأنبوب الموجود على المقعد لتعزيز غرق الدماغ.
4. قم بإزالة المثبت باستخدام ماصة p1000 وقم بغسلتين "سريعتين" باستخدام 500 ميكرولتر من PTN ، مما يسمح للأدمغة بالاستقرار في قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق بين الغسل. خلال هذه الغسيل السريع ، بمجرد أن تستقر جميع الأدمغة بالجاذبية في قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، يمكن استبدال PTN على الفور بمخزن مؤقت جديد. لا يلزم وقت غسيل إضافي.
   ملاحظه: عادة ما يكون ترك حاجز إضافي في الأنبوب أفضل من المخاطرة بإزالة الدماغ. غالبا ما يكون الفحص الدقيق لطرف الماصة مطلوبا لضمان عدم إزالة أي أدمغة عن طريق الخطأ من الأنبوب. إذا تم سحب الأدمغة عن طريق الخطأ في الحافة ، فقم بتوزيعها مرة أخرى في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، وانتظر حتى تستقر الأدمغة ، ثم استمر في إزالة أي PTN متبقي.
5. بعد آخر غسلة سريعة، استخدم ماصة p1000 لإجراء ثلاث غسلات "طويلة": أضف 500 ميكرولتر من PTN واغسلها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على هزاز/مغذيات. يجب أن تكون جميع عمليات الغسيل "الطويلة" المستقبلية لمدة 20 دقيقة.
   ملاحظه: يمكن تخزين الأدمغة الثابتة طوال الليل عند 4 درجات مئوية في PTN بعد هذه الغسل.
6. قم بإزالة الغسيل الأخير باستخدام ماصة p1000 واحتضان الأدمغة على هزاز أو مغذي في درجة حرارة الغرفة في 0.5 مل من محلول المانع [PTN + 5٪ مصل الماعز العادي (NGS)] لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
   1. سيتم استخدام الأجسام المضادة الثانوية للماعز في خطوات البروتوكول اللاحقة. إذا تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية من نوع آخر ، فيجب استخدام المصل الطبيعي من هذا النوع (بدلا من NGS) في محاليل الحجب والأجسام المضادة.
7. باستخدام ماصة p1000، قم بإزالة محلول الانسداد وإضافة الجسم المضاد الأساسي المخفف في PTN (PTN + 5٪ NGS + الجسم المضاد الأولي المخفف). عند استخدام جسم مضاد أولي لأول مرة ، يجب تحديد التخفيف الأمثل لهذا الجسم المضاد تجريبيا.
   ملاحظه: لتصور الخلايا العصبية لجسم الفطر ، عادة ما تستخدم الأجسام المضادة التي تتعرف على Fas2. تتوفر هذه الأجسام المضادة من بنك الورم الهجين للدراسات التنموية (DSHB) كجسم مضاد 1D4 ويجب تخفيفها 1:20 في PTN + 5٪ NGS.
8. احتضان الأدمغة في محلول الأجسام المضادة الأولية على الروك / المغذيات لمدة 2-3 ليال عند 4 درجات مئوية.
9. بعد الحضانة بالأجسام المضادة الأولية ، اسمح للأدمغة بالاستقرار في قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق ثم إزالة محلول الجسم المضاد الأساسي.
10. باستخدام ماصة p1000، قم بإجراء غسلتين "سريعتين" و 3 غسلات "طويلة" لمدة 20 دقيقة باستخدام 0.5 مل من PTN كما هو موضح أعلاه في الخطوتين 1.4 و 1.5، مما يسمح للأدمغة بالاستقرار بعناية عن طريق الجاذبية في قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق بين كل غسلة.
11. احتضان الأدمغة لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المسماة بالفلورسنت. عادة ما يتم تخفيف الأجسام المضادة الثانوية في 0.5 مل من PTN + 5٪ NGS بتركيز 1: 200.
    ملاحظه: بمجرد إضافة الأجسام المضادة الثانوية الفلورية ، يجب إبقاء الأدمغة في الظلام لبقية التجربة.
12. بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية ، اسمح للأدمغة بالاستقرار في قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق وإزالة محلول الجسم المضاد الثانوي.
13. قم بإجراء غسلتين "سريعتين" و 3 غسلات "طويلة" لمدة 20 دقيقة باستخدام 0.5 مل من PTN كما هو موضح أعلاه في الخطوتين 1.4 و 1.5 ، مما يسمح للأدمغة بالاستقرار بعناية في قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق بين كل غسلة.
14. بعد الغسيل الثالث "الطويل" لمدة 20 دقيقة، استخدم ماصة p200 لإزالة أكبر قدر ممكن من العازلة.
15. أضف 75 ميكرولتر من وسيط التركيب الفلوري المضاد للبهتان إلى الدماغ. أدمغة الماصة ووسط التركيب في طرف الماصة مرة واحدة للخلط. لا تقلب الأنبوب لأن الأدمغة قد تصبح عالقة على غطاء أو جوانب أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
    ملاحظه: بعد تعليق الأدمغة في وسط التركيب ، يمكن لف الأنابيب بورق الألمنيوم لإبطاء تبريد الفلوروفور وتخزينها عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين الأدمغة لعدة أيام عند 4 درجات مئوية ولكن يجب تركيبها بشكل مثالي على الشرائح في أسرع وقت ممكن.

< p class = "jove_title" >2. تركيب أدمغة البالغين D. melanogaster على شرائح المجهر والتصوير

1. قم ببناء شريحة "جسر". ضع غطاءين "أساسيين" على بعد 1 سم تقريبا على شريحة موجبة الشحنة. تأكد من أن الجانب المشحون إيجابيا من الشريحة متجها لأعلى. قم بلصق الغطاء على الشريحة باستخدام طلاء الأظافر ، كما هو موضح في الشكل 1 أ. عادة ما يكون إغلاق الحواف الخارجية الثلاثة لكل زلة غطاء قاعدة بطلاء الأظافر مفيدا لضمان عدم فصيلة وسائط التثبيت تحت أغطية القاعدة هذه. اترك طلاء الأظافر يجف تماما (10-15 دقيقة) قبل المتابعة.
2. ضع الشريحة أسفل المجهر المجسم وقم بتثبيت محلول وسائط التثبيت الذي يحتوي على الأدمغة المقطوعة في الفراغ بين الغطاء. لتوفير مزيد من التباين ، من المفيد مناورة الأضواء المنحنية بحيث تكون موازية مع سطح المقعد.
3. قم بإزالة وسائط التثبيت الإضافية من الشريحة باستخدام ماصة ، مع الحرص على عدم سحب الأدمغة من الشريحة.
قم بإزالة
4. وسائط التركيب الإضافية. سيسمح ذلك بوضع الأدمغة بشكل أكثر دقة خلال الخطوة التالية.
5. باستخدام زوج من الملقط والمجهر المجسم ، ضع الأدمغة على الشريحة في نمط شبكي مع مواجهة فصوص الهوائيات لأعلى.
6. ضع زلة غطاء ("الجسر") فوق الدماغ (الشكل 1 أ). استخدم طلاء الأظافر لإغلاق جوانب زلة غطاء الجسر حيث تتلامس مع زلات غطاء "القاعدة".
7. باستخدام ماصة p200، املأ التجويف المركزي أسفل الجسر ببطء بوسائط تركيب جديدة (الشكل 1 ب). ضع قطرة واحدة في كل مرة على الحافة المفتوحة لشريحة الغطاء المركزية واترك وسائط التثبيت تمتد أسفل غطاء الجسر المركزي. استمر حتى يمتلئ التجويف بالكامل بوسائط التثبيت ، ثم أغلق الجزء العلوي والسفلي بطلاء أظافر شفاف.
8. بمجرد أن يجف طلاء الأظافر ، قم بتصوير الشرائح على الفور أو قم بتخزينها في صندوق منزلق محكم مقاوم للضوء عند -20 درجة مئوية.
9. في غضون أسبوع واحد ، صور الأدمغة باستخدام مجهر متحد البؤر بالمسح بالليزر مع ليزر الإثارة ومكعبات الترشيح المناسبة للأجسام المضادة الثانوية الفلورية المختارة. عادة ما يتم الحصول على صور Z-stack للخلايا العصبية لجسم الفطر باستخدام أهداف 20X أو 40X.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. تركيب الأدمغة استعدادا للتصوير المناعي. (أ) يتم تثبيت الأدمغة على شرائح SuperFrost Plus بغطاء جسر لمنع تسطيح الدماغ. يتم لصق منزلتين من الغطاء "الأساسي" على شريحة SuperFrost Plus مشحونة إيجابيا مع طلاء أظافر شفاف ويتم وضع أدمغة مشرحة بينهما. يتم وضع زلة غطاء "الجسر" الواضحة فوق الأدمغة ويتم إلتصاقها بأغطية القاعدة. (ب) بمجرد أن يجف طلاء الأظافر ، يتم سحب Vectashield ببطء تحت الجسر...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ملقط / ملاقط التشريح المجهري تيد بيلا 505-نيو متر أطباق سيلجارد أجهزة النظم الحية DD-50-S-BLK متاح من amazon.com الجسم المضاد Fas2 دراسات التطور بنك الورم الهجين 1 د 4 الجسم المضاد للشوبتين دراسات التطور بنك الورم الهجين 24ب 10 الأجسام المضادة GFP مختبر أفيس غاب 1010 Alexa488 الماعز المضاد للفأر
الجسم المضاد الثانوي ثيرموفيشر أ -11001 Alexa488 ماعز مضاد للدجاج
الجسم المضاد الثانوي ثيرموفيشر أ -11039 Alexa647 الماعز المضاد للجسم المضاد للفأر ثيرموفيشر أ -21236 20٪ بارافورمالدهيد خدمات المجهر الإلكتروني RT15713 فيكتا شيلد مختبرات ناقلات إتش -1000 شرائح SuperFrost Plus ثيرموفيشر 99-910-01 أغطية ثيرموفيشر 12-553-454 Na فوسفات عازلة أحادية القاعدة سيغما S3139 Na فوسفات عازلة ثنائي القاعدة سيغما S3264 تريتون × 100 سيغما X100-100 مل طلاء الأظافر خدمات المجهر الإلكتروني (EMS) 72180 مجهر مجسمة Leica S6D مع مصدر ضوء KL300 LED طبق 9 آبار (طبق بقعة) VWR 89090-482 المغذي / الروك صياد 22-363-152 أو 88-861-041 طبق 35 مم جينيسي العلمية 32-103 سيلجارد صياد 50-366-794 كيمويب صياد 06-666 مخازن التثبيت المحتملة PTN المخزن المؤقت 0.1 مليون فوسفات الصوديوم ، درجة الحموضة 7.2 ، 0.1٪ تريتون-X-100 ، عادة ما تشكل 0.5 لتر من عازلة NaPhosphate 0.1M و aliquote 50 مل في المرة الواحدة حسب الحاجة أسهم الطيران المتاحة من بلومنجتون إيلاف (c155) -GAL4 BL458 عموم الخلايا العصبية GAL4 سائق ث *؛؛؛ OK107-GAL4 BL 854 سائق GAL4 لجميع الخلايا العصبية لجسم الفطر (إدخال OK107-GAL4 على الكروموسوم الرابع) ذ (1) ، ث (67 ج 23) ؛ c739 - GAL4 بليو 7362 برنامج تشغيل GAL4 لفصوص ألفا وبيتا (على الكروموسوم الثاني) ذ (1) ، ث (67c23) ؛ c739-GAL4 ، UAS- CD8-GFP بليو 64305 يحتوي برنامج تشغيل GAL4 لفصوص ألفا وبيتا أيضا على UAS-CD8- GFP ث *؛ 201Y-GAL4 4440 بليو سائق GAL4 لفصوص جاما في جسم الفطر في المقام الأول (على الكروموسوم الثاني) ذ (1) ، ث (67c23) ؛ 201Y-GAL4 ، UAS- CD8-GFP بليو 64296 يحتوي برنامج تشغيل GAL4 لفصوص جاما لجسم الفطر أيضا على UAS- CD8-GFP