إحداث التهاب عصبي في يرقات الزرد بحقن عديدات السكاريد الدهنية

الملخص

المصدر: He, Y. et al. الحقن المجهري للدماغ البطيني لعديدات السكاريد الدهنية في يرقات أسماك الزرد لتقييم الالتهاب العصبي والسمية العصبية. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح الفيديو الحقن المجهري لعديدات السكاريد الدهنية (LPS) في أدمغة يرقات سمك الزرد للحث على التهاب الأعصاب. يتم وضع اليرقات على طبق مبطن بالأغروز ، ويتم إدخال الإبرة في بطينين الدماغ ، ويتم حقن LPS. يؤدي LPS المحقون إلى استجابة مناعية تؤدي إلى التهاب الأعصاب.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. التحضير للحقن المجهري

1. استعد للحقن عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام مجتذب ماصة دقيقة (انظر جدول المواد) ، باتباع البروتوكول المكون من خمس خطوات لسحب الأنبوب الشعري الزجاجي (الجدول 1).
2. افتح طرف الإبرة (الشعيرات الدموية الزجاجية ذات الجدار الرقيق [3.5 بوصة] مع خيوط ، القطر الخارجي [OD] 1.14 مم) بالحجم المناسب بزاوية باستخدام الملقط (الشكل 1 أ).
3. املأ الإبرة ب 0.1 مل من الزيت المعدني للتأكد من عدم وجود فقاعات.
4. قم بإزالة الغطاء اللولبي للإبرة الفولاذية لجهاز الحقن المجهري. قم بمحاذاة فتحة الإبرة الزجاجية مع الإبرة الفولاذية ثم شد الغطاء اللولبي. قم بتركيب جهاز الحقن الدقيق بالإبرة المحملة في معالج دقيق (انظر جدول المواد).
5. اضبط موضع جهاز الحقن الدقيق بحيث يمكن للمناور الدقيق تحريك الجهاز بمرونة تحت المجهر. قم بتفريغ كمية معينة من زيت البارافين لجعل الإبرة الفولاذية تدخل الأنبوب الزجاجي الشعري.
6. قم بإسقاط محلول الحقن (مثل 1× محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو 5 مجم / مل LPS) على شريحة زجاجية معقمة بنسبة 70٪ من الإيثانول واضبط جهاز الحقن الدقيق بحيث يتم إدخال الطرف في قطرة السائل. قم بتحميل ~ 2 ميكرولتر من محلول الحقن في الإبرة.
7. قم بإعداد جهاز المعالجة الدقيقة (إعدادات الضبط الدقيقة لأعلى ولأسفل واليسار واليمين) بحيث يكون طرف الإبرة لجهاز الحقن المجهري في نفس مجال الرؤية مثل اليرقات عند التكبير العالي (الشكل 1 ب).

< ص الفئة = "jove_title" >2. تركيب سمك الزرد للحقن المجهري

< p class = "jove_content" >ملاحظة: يحدث نمو دماغ أسماك الزرد في غضون 3 أيام بعد الإخصاب (dpf) وينضج عند 5 dpf مع جهاز عصبي مركزي متطور. لذلك ، فإن 5 يرقات dpf مناسبة بالفعل لدراسة الضرر العصبي بوساطة LPS بالإضافة إلى الاستجابات السلوكية والالتهابية.

1. حقن يرقات الزرد في غضون 30 دقيقة تقريبا من الوصول إلى مرحلة الاهتمام ، للحفاظ على اتساق توقيت الحقن.
2. لتخدير يرقات الزرد ، امزج التريكيين مع مياه خزان الأسماك النظيفة (التركيز النهائي 0.02٪ وزن / حجم من التريكائين).
3. قم بإذابة محلول 2٪ agarose في ماء مقطر مزدوج (ddH₂O) باستخدام الميكروويف. صب الاغاروز المنصهر في طبق بلاستيكي. يمكن تخزين الطبق البلاستيكي المطلي بالأغاروز بنسبة 2٪ عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
4. استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل اليرقات المخدرة إلى وسط الطبق البلاستيكي المطلي بالأغاروز بنسبة 2٪. قم بتوجيه اليرقات المثبتة بحيث يكون جانب الدماغ لأعلى للوصول إلى الإبرة.

< p class = "jove_title" >3. حقن بطين الدماغ

1. اضبط تكبير المجهر بحيث يتم عرض الهيكل البطيني للدماغ لأسماك الزرد بوضوح في مجال الرؤية (الشكل 1 ب).
2. ضع الإبرة بعناية فوق تكتوم الدماغ (الشكل 1 ج).
3. ثقب جلد دماغ الزرد بطرف الإبرة ببطء باستخدام أداة المعالجة الدقيقة.
4. اضغط على دواسة القدم لإخراج 1 نانولتر من 1x PBS أو تركيزات مختلفة من LPS (1.0 و 2.5 و 5.0 مجم / مل) (انظر جدول المواد). تظهر صور حقن البطين الناجحة التي تم فيها حقن بطين الدماغ ب 1 نانولتر من صبغة إيفانز الزرقاء 1٪ (المخففة في PBS) كمثال (الشكل 1 د). انقل اليرقات إلى وسط ماء البيض النظيف (E3) مباشرة بعد الحقن. بعد 24 ساعة ، اجمع اليرقات للتصوير المجهري ، والفحص السلوكي للقاطرة ، وتحديد المؤشرات الأخرى.

النتائج

p class = "jove_content" >الجدول 1: بروتوكول من خمس خطوات لسحب الأنبوب الشعري الزجاجي.

درج وقت التشغيل (ثانية) مستوى الحرارة فعل تي 1 ل> H80-89 P1L005 ت2 1.6-3 H00 ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أغاروز سيجما ألدريتش أ 6361 الاغاروز ، درجة حرارة التبلور المنخفضة سيجما ألدريتش أ 9414 حاقن Drummond Nanoject III القابل للبرمجة دروموند العلمي 3-000-207 مجاهر ستيريو مضان لايكا M205 FA عديدات السكاريد الدهنية من الإشريكية القولونية O111: B4 سيجما ألدريتش L3024 مناور دقيق يدوي أدوات الدقة العالمية م 3301 الزيوت المعدنية سيجما ألدريتش م 5904 محلول ملحي مخزن بالفوسفات سيجما ألدريتش ص 4417 الشعيرات الدموية الزجاجية رقيقة الجدار (4 بوصات) مع خيوط ، OD 1.5 مم أدوات الدقة العالمية TW150F-4 التريكايين (3-أمينو البنزويك إيثيل إستر) سيجما ألدريتش أ -5040