نمذجة الموت العصبي الناجم عن أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية للفأر

< p class = "jove_title" >1. التحضير التجريبي

ملاحظة: يمكن تحضير حلول المخزون التالية وصيانتها حتى الاستخدام.

1. حل التشريح
   1. قم بإذابة 3.62 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl) ، و 0.2 جم من كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، و 0.069 جم من فوسفات الصوديوم (NaH₂PO₄ ∙ H₂O) ، و 1.306 جم من D- (+) -Glucose في 500 مل من H₂O المقطر. بعد ذلك ، أضف 12.5 مل من HEPES Buffer ، و 450 ميكرولتر من محلول الفينول الأحمر ، و 20 مل من ألبومين مصل البقر (BSA) الجزء V إلى المحلول. اضبط على درجة الحموضة 7.4 باستخدام 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم).
   2. تعقيم بفلتر 0.22 ميكرومتر وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية. سيظل هذا الحل مستقرا لمدة تصل إلى أسبوع إلى 10 أيام.
2. التربسين
   1. تحضير محلول مخزون بتركيز 25 جم / لتر من التربسين في 0.9٪ كلوريد الصوديوم. قم بتخزين المحلول عند -20 درجة مئوية.
3. مثبط التربسين
   1. تحضير مرق بتركيز 10 مجم / مل عن طريق إذابة 1 جم من مثبط التربسين بياض بيض الدجاج في 100 مل من 1 ملي مولار حمض الهيدروكلوريك ، قم بتخزين هذا المحلول عند -20 درجة مئوية.
4. ديوكسيربونوكلياز (DNase)
   1. قم بإذابة 100 مجم من DNase 1 في 10 مل من الماء المعقم لتوليد مخزون 10 مجم / مل. قم بتخزين المحلول عند -20 درجة مئوية.
5. MgSO₄
   1. أضف 6.02 جم من كبريتات المغنيسيوم (MgSO₄) إلى 50 مل من الماء المقطر (H₂O) لتوليد مخزون 1 متر. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
6. كلوريد_{الهواء 2}
   1. قم بإذابة 0.735 جم من كلوريد الكالسيوم (CaCl₂∙ 2H₂O) في 50 مل من H₂O المقطر إلى تركيز مخزون 100 مل. تخزين المحلول في 4 درجات مئوية.
7. كيه سي إل
   1. قم بإذابة 3.7275 جم من KCl في 50 مل من H₂O المقطر إلى تركيز مخزون 1 M. يخزن المحلول في 4 درجات مئوية.
8. د- (+) - جلوكوز
   1. قم بإذابة 1.802 جم من D- (+) -glucose في 50 مل من H₂O المقطر إلى تركيز مخزون 100 مل. تخزين المحلول في 4 درجات مئوية.
9. وسائط زراعة الخلية
   1. تحضير وسائط زراعة الخلايا على النحو التالي: 5 مل من مصل الأبقار الجنينية المعطلة بالحرارة ، و 500 ميكرولتر من 200 ملي لتر من الجلوتامين ، و 100 ميكرولتر من 50 مجم / مل جنتاميسين و 1.0 مل من 1.0 M KCL يجب تضيفها إلى 45 مل من الحد الأدنى من الوسائط الأساسية المعقمة للمرشح (E-MEM) التي يتم استكمالها ب 1.125 جم / لتر D-Glucose لتوليد 50 مل من وسائط زراعة الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية (CGN). تخزين الوسائط في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
10. السيتوزين بيتا د- أرابينو فورانوسيد
    1. قم بإذابة 48 مجم من السيتوزين بيتا-د-أرابينو فورانوزيد في 10 مل من وسائط النمو بتركيز مخزون 20 ملم. تخزين المحلول عند -20 درجة مئوية.
11. بولي د-يسين
    1. لتوليد مخزون 2 ملغ / مل بولي D-lysine ، أضف 10 مل من H₂O المعقم إلى 20 مجم من بولي D-lysine. يجب تخزين مخزون بولي D-lysine عند -80 درجة مئوية في 100 ميكرولتر من الحصص
       ملاحظه: يجب تحضير المحاليل التالية قبل التشريح والحفاظ عليها عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
محلول
12. التشريح المكملة MgSO₄
    1. أضف 300 ميكرولتر من المخزون MgSO₄ إلى 250 مل من محلول التشريح.
13. محلول تشريح التربسين
    1. أضف 100 ميكرولتر من التربسين و 12 ميكرولتر من المخزون MgSO₄ إلى 10 مل من محلول التشريح.
14. محلول مثبط التربسين 1
    1. أضف 164 ميكرولتر من مثبط التربسين ، و 250 ميكرولتر من DNase 1 و 12 ميكرولتر من مخزون MgSO₄ إلى 10 مل من محلول التشريح.
15. محلول مثبط التربسين 2
    1. أضف 1040 ميكرولتر من مثبط التربسين ، و 750 ميكرولتر من DNase 1 و 12 ميكرولتر من مخزون MgSO₄ إلى 10 مل من محلول التشريح.
16. محلول تشريح مكمل CaCl₂
    1. أضف 10 ميكرولتر من مخزون CaCl₂ و 25 ميكرولتر من المخزون MgSO₄ إلى 10 مل من محلول التشريح.
17. أطباق الثقافة المغلفة بولي D-Lysine
    1. لتغليف أطباق الاستزراع ، قم بتخفيف 100 ميكرولتر من مخزون بولي D-lysine في 40 مل من H₂O المعقم. لأطباق ثقافة Nunc مقاس 35 مم ، أضف 2 مل من محلول بولي D-Lysine المخفف. للحصول على 4 ألواح آبار ، أضف 300 ميكرولتر من بولي D-Lysine المخفف إلى كل بئر.
    2. دع بولي D-lysine يجلس لمدة 1 ساعة قبل الشفط وغسل كل بئر ب 4 مل أو 600 ميكرولتر (لأطباق ثقافة 35 مم أو 4 أطباق بئر ، على التوالي) من H₂O المعقمة. ثم استنشق H₂O واترك الأطباق تجف في الهواء لمدة 1 ساعة.

< p class = "jove_title" >2. استخراج الدماغ وعزل المخيخ

1. اقطع رأس جرو فأر يبلغ من العمر 6-7 أيام باستخدام مقص قطع الرأس. قم بإجراء تشريح الدماغ في غطاء مزرعة الأنسجة المعقمة.
2. لإزالة الدماغ ، أمسك الرأس باستخدام زوج من الملقط واقطع الجلد باتجاه الجزء الأمامي من الرأس باستخدام مقص التشريح المجهري كما هو موضح في الشكل 1. ثم قم بقطع عظم الجمجمة باستخدام مقص جديد لتقليل مخاطر التلوث. قم بإزالة الجمجمة التي تغطي الدماغ باستخدام الملقط وإخراج الدماغ باستخدام ملقط أو ملعقة.
   1. حسب الحاجة ، قم بقطع العصب البصري لتسهيل إخراج الدماغ ككل.
3. ضع الدماغ في محلول التشريح ، والذي يتم استكماله ب MgSO₄. حافظ على المحلول والدماغ على الجليد.
4. بعد إزالة الدماغ ، تحت مجهر التشريح ، قم بتشريح المخيخ من الدماغ بينما لا يزال في محلول التشريح المكمل MgSO₄ ، وقم بإزالة السحايا باستخدام ملقط دقيق. اقلب المخيخ إلى جانبه البطني وتأكد من إزالة الضفيرة المشيمية.
5. ضع المخيخ في طبق مقاس 35 مم يحتوي على ~ 1 مل من محلول التشريح المكممل MgSO₄.
6. يقطع الأنسجة إلى قطع صغيرة وينقل إلى أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 30 مل من محلول التشريح المخزن MgSO₄.

< p class = "jove_title" >3. عزل الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية للفأر والزراعت

1. جهاز طرد مركزي الأنبوب سعة 50 مل الذي يحتوي على الأنسجة الدماغية المفرومة لمدة 5 دقائق عند 644 × جم و 4 درجات مئوية.
2. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 10 مل من محلول تشريح التربسين. ثم قم بهز الأنبوب بسرعة عالية لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
3. أضف 10 مل من محلول مثبط التربسين 1 إلى الأنبوب وقم بالصخور برفق لمدة دقيقتين.
4. جهاز الطرد المركزي للأنبوب لمدة 5 دقائق عند 644 × جم و 4 درجات مئوية.
5. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 2 مل من محلول مثبط التربسين 2 ، ثم انقله إلى أنبوب سعة 15 مل.
6. قم بترتيورث الأنسجة في أنبوب 15 مل حتى يصبح المحلول غامضا. ثم اتركه يستقر لمدة 5 دقائق.
7. قم بإزالة المادة الطافية الصافية وانقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد يحتوي على 1 مل من محلول التشريح المكمل بكالوريد_{الكالسيوم 2}.
8. أضف مل آخر من محلول مثبط التربسين 2 إلى قاع الأنبوب الذي يحتوي على الحبيبات من الخطوة 3.6. ثلاثي الأبعاد مرة أخرى واتركه يستقر لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأضفها إلى الأنبوب الذي يحتوي على المادة الطافية من الخطوة 3.7 (هذا تكرار للخطوات 3.6-3.7). كرر هذه العملية حتى يتم فصل معظم الأنسجة ميكانيكيا.
9. أضف 0.3 مل من محلول التشريح المكمل بكلوريد الكالسيوم₂ إلى مجموعة المواد الطافية لكل مل من المادة الطافية.
10. امزج محتويات الأنبوب ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 644 × جم.
11. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 10 مل من الوسائط الطازجة إلى الحبيبات واخلطها.
12. يمكن بعد ذلك حساب الخلايا وتخفيفها إلى تركيز 1.5 × 10⁶ خلايا / مل. يرجى ملاحظة أنه بشكل عام ، من المتوقع أن يكون هناك 10 ملايين خلية من كل دماغ تم تشريحه ، اعتمادا على وقت التربسين وكفاءة التشريح. خلايا الصفيحة على ألواح بولي D-lysine المصنوعة مسبقا. بالنسبة للألواح المكونة من 4 آبار ، لوحة 0.5 مل ، مما يعطي 7.5 × 10⁵ خلايا لكل بئر. بالنسبة للأطباق مقاس 35 مم ، طبق 4 مل ، مع إعطاء 6 × 10⁶ خلايا لكل طبق.
13. بعد 24 ساعة ، أضف السيتوزين β أرابينو فورانوزيد (AraC) إلى الألواح لتقليل التلوث الدبقي. لكل مل من الوسائط ، يلزم 0.5 ميكرولتر من 20 ملي مولار AraC. لا تتطلب إضافة AraC تغييرا في الوسائط. إذا كان سيتم الحفاظ على الخلايا لمدة 7-8 أيام ، كرر هذا العلاج في اليوم 3.
14. الحفاظ على المزارع في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{5٪ عند} 37 درجة مئوية وإطعامها ب 100 ميكرولتر من 100 ملي مولار من الجلوكوز المضاف إلى المزرعة لكل 2 مل من الوسائط كل يومين بعد 5 أيام. لا يلزم إجراء تغيير كامل للوسائط.

< p class = "jove_title" >4. نمذجة إصابة الخلايا العصبية

1. للحث على موت الخلايا الناجم عن ROS (الإجهاد التأكسدي) ، عالج الخلايا العصبية ببيروكسيد الهيدروجين 75-100 ميكرومتر (H₂O₂) وانتقل إلى الوسائط المكيفة من الثقافات المتوازية بعد التعرض لمدة 5 دقائق ل H₂O₂. لاحظ ، نظرا لعدم استقرار H₂O₂ ، قم بتحسين التركيز إلى مستوى يؤدي إلى موت الخلايا بنسبة 50-70٪ في الثقافة بعد 24 ساعة من العلاج (الشكل 2).

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: إزالة دماغ الفأر وتشريح المخيخ. (أ) لاستخراج دماغ فأر عمره 6-7 أيام ، باستخدام زوج من الملقط ، أمسك الرأس وقطع الجلد من الأمام على طول الخطوط المنقطة باستخدام زوج من مقص التشريح المجهري. احرص على قطع الجلد والأنسجة الضامة فقط ، فقد يؤدي الشق العميق جدا إلى ثقب الجمجمة وإتلاف الدماغ. تسمح هذه الشقوق الثلاثة ، مباشرة على طول خط الوسط ، واثنان منحنيان بشكل جانبي ، بدفع الجلد للخلف لتكشف عن الجمجمة. بمجرد تعرضها ، يمكن اختراق الجمجمة بطرف المقص ، وقطعها من الأمام. يجب توخي الحذر الشديد لعدم إتلاف المخيخ لتسهيل التعرف على السحايا وإزالتها. بمجرد القطع ، يمكن استخدام الملقط لتقشير الجمجمة ، وتعريض الدماغ الذي يمكن بعد ذلك إزعاجه في محلول تشريح بارد باستخدام زوج من الملقط أو الملعقة. من أجل إزالة الدماغ، قد يحتاج العصب البصري إلى قطعه. (ب) بمجرد إزالتها من الجمجمة ، يجب إزالة السحايا من المخيخ باستخدام زوج من الملقط ذي الرؤوس الدقيقة. (ج) باستخدام زوج من الملقط ذي الرؤوس الدقيقة ، يتم تشريح المخيخ من الأنسجة المتبقية وفحصه لضمان الإزالة الكاملة للسحايا.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2: نمذجة إصابة الخلايا العصبية في الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية. يتم فصل المخيخ المعزول من اليوم 6-7 للفئران إلى خلايا مفردة باتباع الإجراء الوارد في الجزء 3. بعد التفكك ، يتم حساب الخلايا وإعادة تعليقها في حجم من وسائط الثقافة لتوليد 1.5 × 106 خلايا / مل ، بالنسبة للأطباق مقاس 35 مم ، يتم طلاء 4 مل ، مما يعطي 6 × 106 خلايا لكل لوحة. بالنسبة لشرائح التصوير ، يتم طلاء 0.5 مل ، مما يعطي 7.5 × 105 خلايا / بئر. يمكن بعد ذلك نقل CGNs بفيروس العدسي أو الإصابة بالفيروس الغدي. يعطي استخدام الفيروس الغدي في يوم الطلاء (0 يوم في المختبر (DIV)) كفاءة تعداء أكبر من 90٪ ويسمح بدراسة إصابة الخلايا العصبية من خلال الإجهاد التأكسدي وتلف الحمض النووي. ستؤدي إضافة 10 ميكرومتر كامبتوثيسين (CPT) إلى تلف الحمض النووي ، في حين أن بيروكسيد الهيدروجين 75-100 ميكرومتر (H2O2) سيؤدي إلى الإجهاد التأكسدي. يجب تحسين تركيز H2O2 للحث على موت الخلايا بنسبة 50٪ بعد 24 ساعة. تعطي الإصابة بالفيروسات الغدية عند 5 DIV كفاءة نقل أقل من 10٪. في 7 DIV عندما يتم إثراء مستقبلات NMDA في الثقافة ، يمكن معالجة الخلايا العصبية ب 100 ميكرومتر NMDA و 10 ميكرومتر جلايسين للحث على السمية المثيرة. هذا مثالي لتحليل التصوير اللاحق أو تتبع خلية عصبية واحدة. أخيرا ، فإن التحويل باستخدام فيروس العدسات عند 0 DIV ، متبوعا بالمعالجة ب 100 ميكرومتر NMDA و 10 ميكرومتر جلايسين عند 7 DIV ، يعطي كفاءة نقل عالية بما فيه الكفاية (>80٪) للسماح بالتحليل الكيميائي الحيوي للثقافة ، بما في ذلك تسلسل ChIP ، وفحص تعبير البروتين ، وإجراء فحوصات حية / ميتة.