نمذجة الموت العصبي الناجم عن أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية للفأر

الملخص

المصدر: Laaper، M. et al.، نمذجة الموت والانحطاط العصبي في الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية الأولية للفأر.J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو إنشاء نموذج إصابة الخلايا العصبية باستخدام أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية الأولية للفأر. يفصل عملية إحداث الإجهاد التأكسدي عن طريق إضافة تركيزات عالية من بيروكسيد الهيدروجين. يتسبب التعرض ل ROS في كسر خيوط الحمض النووي وعدم الاستقرار الجيني. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أكسدة البروتينات الخلوية تضعف وظائفها ، بينما يضر بيروكسيد الدهون بسلامة الغشاء. يؤدي هذا الشلال إلى إطلاق السيتوكروم سي وتنشيط الكاسباز ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج العصبي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. التحضير التجريبي

ملاحظة: يمكن تحضير حلول المخزون التالية وصيانتها حتى الاستخدام.

1. حل التشريح
   1. قم بإذابة 3.62 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl) ، و 0.2 جم من كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، و 0.069 جم من فوسفات الصوديوم (NaH₂PO₄ ∙ H₂O) ، و 1.306 جم من D- (+) -Glucose في 500 مل من H₂O المقطر. بعد ذلك ، أضف 12.5 مل من HEPES Buffer ، و 450 ميكرولتر من محلول الفينول الأحمر ، و 20 مل من ألبومين مصل البقر (BSA) الجزء V إلى المحلول. اضبط على درجة الحموضة 7.4 باستخدام 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم).
   2. تعقيم بفلتر 0.22 ميكرومتر وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية. سيظل هذا الحل مستقرا لمدة تصل إلى أسبوع إلى 10 أيام.
2. التربسين
   1. تحضير محلول مخزون بتركيز 25 جم / لتر من التربسين في 0.9٪ كلوريد الصوديوم. قم بتخزين المحلول عند -20 درجة مئوية.
3. مثبط التربسين
   1. تحضير مرق بتركيز 10 مجم / مل عن طريق إذابة 1 جم من مثبط التربسين بياض بيض الدجاج في 100 مل من 1 ملي مولار حمض الهيدروكلوريك ، قم بتخزين هذا المحلول عند -20 درجة مئوية.
4. ديوكسيربونوكلياز (DNase)
   1. قم بإذابة 100 مجم من DNase 1 في 10 مل من الماء المعقم لتوليد مخزون 10 مجم / مل. قم بتخزين المحلول عند -20 درجة مئوية.
5. MgSO₄
   1. أضف 6.02 جم من كبريتات المغنيسيوم (MgSO₄) إلى 50 مل من الماء المقطر (H₂O) لتوليد مخزون 1 متر. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
6. كلوريد_{الهواء 2}
   1. قم بإذابة 0.735 جم من كلوريد الكالسيوم (CaCl₂∙ 2H₂O) في 50 مل من H₂O المقطر إلى تركيز مخزون 100 مل. تخزين المحلول في 4 درجات مئوية.
7. كيه سي إل
   1. قم بإذابة 3.7275 جم من KCl في 50 مل من H₂O المقطر إلى تركيز مخزون 1 M. يخزن المحلول في 4 درجات مئوية.
8. د- (+) - جلوكوز
   1. قم بإذابة 1.802 جم من D- (+) -glucose في 50 مل من H₂O المقطر إلى تركيز مخزون 100 مل. تخزين المحلول في 4 درجات مئوية.
9. وسائط زراعة الخلية
   1. تحضير وسائط زراعة الخلايا على النحو التالي: 5 مل من مصل الأبقار الجنينية المعطلة بالحرارة ، و 500 ميكرولتر من 200 ملي لتر من الجلوتامين ، و 100 ميكرولتر من 50 مجم / مل جنتاميسين و 1.0 مل من 1.0 M KCL يجب تضيفها إلى 45 مل من الحد الأدنى من الوسائط الأساسية المعقمة للمرشح (E-MEM) التي يتم استكمالها ب 1.125 جم / لتر D-Glucose لتوليد 50 مل من وسائط زراعة الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية (CGN). تخزين الوسائط في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
10. السيتوزين بيتا د- أرابينو فورانوسيد
    1. قم بإذابة 48 مجم من السيتوزين بيتا-د-أرابينو فورانوزيد في 10 مل من وسائط النمو بتركيز مخزون 20 ملم. تخزين المحلول عند -20 درجة مئوية.
11. بولي د-يسين
    1. لتوليد مخزون 2 ملغ / مل بولي D-lysine ، أضف 10 مل من H₂O المعقم إلى 20 مجم من بولي D-lysine. يجب تخزين مخزون بولي D-lysine عند -80 درجة مئوية في 100 ميكرولتر من الحصص
       ملاحظه: يجب تحضير المحاليل التالية قبل التشريح والحفاظ عليها عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
محلول
12. التشريح المكملة MgSO₄
    1. أضف 300 ميكرولتر من المخزون MgSO₄ إلى 250 مل من محلول التشريح.
13. محلول تشريح التربسين
    1. أضف 100 ميكرولتر من التربسين و 12 ميكرولتر من المخزون MgSO₄ إلى 10 مل من محلول التشريح.
14. محلول مثبط التربسين 1
    1. أضف 164 ميكرولتر من مثبط التربسين ، و 250 ميكرولتر من DNase 1 و 12 ميكرولتر من مخزون MgSO₄ إلى 10 مل من محلول التشريح.
15. محلول مثبط التربسين 2
    1. أضف 1040 ميكرولتر من مثبط التربسين ، و 750 ميكرولتر من DNase 1 و 12 ميكرولتر من مخزون MgSO₄ إلى 10 مل من محلول التشريح.
16. محلول تشريح مكمل CaCl₂
    1. أضف 10 ميكرولتر من مخزون CaCl₂ و 25 ميكرولتر من المخزون MgSO₄ إلى 10 مل من محلول التشريح.
17. أطباق الثقافة المغلفة بولي D-Lysine
    1. لتغليف أطباق الاستزراع ، قم بتخفيف 100 ميكرولتر من مخزون بولي D-lysine في 40 مل من H₂O المعقم. لأطباق ثقافة Nunc مقاس 35 مم ، أضف 2 مل من محلول بولي D-Lysine المخفف. للحصول على 4 ألواح آبار ، أضف 300 ميكرولتر من بولي D-Lysine المخفف إلى كل بئر.
    2. دع بولي D-lysine يجلس لمدة 1 ساعة قبل الشفط وغسل كل بئر ب 4 مل أو 600 ميكرولتر (لأطباق ثقافة 35 مم أو 4 أطباق بئر ، على التوالي) من H₂O المعقمة. ثم استنشق H₂O واترك الأطباق تجف في الهواء لمدة 1 ساعة.

< p class = "jove_title" >2. استخراج الدماغ وعزل المخيخ

1. اقطع رأس جرو فأر يبلغ من العمر 6-7 أيام باستخدام مقص قطع الرأس. قم بإجراء تشريح الدماغ في غطاء مزرعة الأنسجة المعقمة.
2. لإزالة الدماغ ، أمسك الرأس باستخدام زوج من الملقط واقطع الجلد باتجاه الجزء الأمامي من الرأس باستخدام مقص التشريح المجهري كما هو موضح في الشكل 1. ثم قم بقطع عظم الجمجمة باستخدام مقص جديد لتقليل مخاطر التلوث. قم بإزالة الجمجمة التي تغطي الدماغ باستخدام الملقط وإخراج الدماغ باستخدام ملقط أو ملعقة.
   1. حسب الحاجة ، قم بقطع العصب البصري لتسهيل إخراج الدماغ ككل.
3. ضع الدماغ في محلول التشريح ، والذي يتم استكماله ب MgSO₄. حافظ على المحلول والدماغ على الجليد.
4. بعد إزالة الدماغ ، تحت مجهر التشريح ، قم بتشريح المخيخ من الدماغ بينما لا يزال في محلول التشريح المكمل MgSO₄ ، وقم بإزالة السحايا باستخدام ملقط دقيق. اقلب المخيخ إلى جانبه البطني وتأكد من إزالة الضفيرة المشيمية.
5. ضع المخيخ في طبق مقاس 35 مم يحتوي على ~ 1 مل من محلول التشريح المكممل MgSO₄.
6. يقطع الأنسجة إلى قطع صغيرة وينقل إلى أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 30 مل من محلول التشريح المخزن MgSO₄.

< p class = "jove_title" >3. عزل الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية للفأر والزراعت

1. جهاز طرد مركزي الأنبوب سعة 50 مل الذي يحتوي على الأنسجة الدماغية المفرومة لمدة 5 دقائق عند 644 × جم و 4 درجات مئوية.
2. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 10 مل من محلول تشريح التربسين. ثم قم بهز الأنبوب بسرعة عالية لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
3. أضف 10 مل من محلول مثبط التربسين 1 إلى الأنبوب وقم بالصخور برفق لمدة دقيقتين.
4. جهاز الطرد المركزي للأنبوب لمدة 5 دقائق عند 644 × جم و 4 درجات مئوية.
5. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 2 مل من محلول مثبط التربسين 2 ، ثم انقله إلى أنبوب سعة 15 مل.
6. قم بترتيورث الأنسجة في أنبوب 15 مل حتى يصبح المحلول غامضا. ثم اتركه يستقر لمدة 5 دقائق.
7. قم بإزالة المادة الطافية الصافية وانقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد يحتوي على 1 مل من محلول التشريح المكمل بكالوريد_{الكالسيوم 2}.
8. أضف مل آخر من محلول مثبط التربسين 2 إلى قاع الأنبوب الذي يحتوي على الحبيبات من الخطوة 3.6. ثلاثي الأبعاد مرة أخرى واتركه يستقر لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأضفها إلى الأنبوب الذي يحتوي على المادة الطافية من الخطوة 3.7 (هذا تكرار للخطوات 3.6-3.7). كرر هذه العملية حتى يتم فصل معظم الأنسجة ميكانيكيا.
9. أضف 0.3 مل من محلول التشريح المكمل بكلوريد الكالسيوم₂ إلى مجموعة المواد الطافية لكل مل من المادة الطافية.
10. امزج محتويات الأنبوب ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 644 × جم.
11. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 10 مل من الوسائط الطازجة إلى الحبيبات واخلطها.
12. يمكن بعد ذلك حساب الخلايا وتخفيفها إلى تركيز 1.5 × 10⁶ خلايا / مل. يرجى ملاحظة أنه بشكل عام ، من المتوقع أن يكون هناك 10 ملايين خلية من كل دماغ تم تشريحه ، اعتمادا على وقت التربسين وكفاءة التشريح. خلايا الصفيحة على ألواح بولي D-lysine المصنوعة مسبقا. بالنسبة للألواح المكونة من 4 آبار ، لوحة 0.5 مل ، مما يعطي 7.5 × 10⁵ خلايا لكل بئر. بالنسبة للأطباق مقاس 35 مم ، طبق 4 مل ، مع إعطاء 6 × 10⁶ خلايا لكل طبق.
13. بعد 24 ساعة ، أضف السيتوزين β أرابينو فورانوزيد (AraC) إلى الألواح لتقليل التلوث الدبقي. لكل مل من الوسائط ، يلزم 0.5 ميكرولتر من 20 ملي مولار AraC. لا تتطلب إضافة AraC تغييرا في الوسائط. إذا كان سيتم الحفاظ على الخلايا لمدة 7-8 أيام ، كرر هذا العلاج في اليوم 3.
14. الحفاظ على المزارع في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{5٪ عند} 37 درجة مئوية وإطعامها ب 100 ميكرولتر من 100 ملي مولار من الجلوكوز المضاف إلى المزرعة لكل 2 مل من الوسائط كل يومين بعد 5 أيام. لا يلزم إجراء تغيير كامل للوسائط.

< p class = "jove_title" >4. نمذجة إصابة الخلايا العصبية

1. للحث على موت الخلايا الناجم عن ROS (الإجهاد التأكسدي) ، عالج الخلايا العصبية ببيروكسيد الهيدروجين 75-100 ميكرومتر (H₂O₂) وانتقل إلى الوسائط المكيفة من الثقافات المتوازية بعد التعرض لمدة 5 دقائق ل H₂O₂. لاحظ ، نظرا لعدم استقرار H₂O₂ ، قم بتحسين التركيز إلى مستوى يؤدي إلى موت الخلايا بنسبة 50-70٪ في الثقافة بعد 24 ساعة من العلاج (الشكل 2).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: إزالة دماغ الفأر وتشريح المخيخ. (أ) لاستخراج دماغ فأر عمره 6-7 أيام ، باستخدام زوج من الملقط ، أمسك الرأس وقطع الجلد من الأمام على طول الخطوط المنقطة باستخدام زوج من مقص التشريح المجهري. احرص على قطع الجلد والأنسجة الضامة فقط ، فقد يؤدي الشق العميق جدا إلى ثقب الجمجمة وإتلاف الدماغ. تسمح هذه الشقوق الثلاثة ، مباشرة على طول خط الوسط ، واثنان منحنيان بشكل جانبي ، بد...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات طقم المعايرة بالتحليل الحجمي العدسي qPCR ABM #LV900 حل سريع لتنقية الفيروسات ABM #LV999 pCMV-dR8.2 أدجين #8455 pCMV-VS.VG أدجين #8454 ماء مقطر جيبكو #15230162 200 ملي ل-جلوتامين جيبكو #25030081 أطباق ثقافة Nunc مقاس 35 مم جيبكو #174913 PowerUP SYBR مزيج رئيسي أخضر تقنيات الحياة #A25742 حل BSA V سيجما ألدريتش #A-8412 CaCl2 • 2H2O سيجما ألدريتش #C-7902 كامبتوثيسين سيجما ألدريتش #C-9911 مثبط بياض بيض الدجاج سيجما ألدريتش #10109878001 السيتوزين بيتا د-أرابينو فورانوسيد سيجما ألدريتش #C-1768 د- (+) - جلوكوز سيجما ألدريتش #G-7528 DNase1 سيجما ألدريتش #11284932001 النسر الحد الأدنى من الوسط الأساسي سيجما ألدريتش #M-2279 جلايسين سيجما ألدريتش #G-5417 مصل الأبقار الجنينية المعطلة بالحرارة سيجما ألدريتش #F-0392 هيبس عازلة سيجما ألدريتش #H-0887 بيروكسيد الهيدروجين سيجما ألدريتش #216763 50 ملغم/مل جنتامايسين سيجما ألدريتش #G-1397 MgSO4 سيجما ألدريتش #M-2643 حمض N-Methyl-D-الأسبارتيك سيجما ألدريتش #M-3262 محلول الفينول الأحمر سيجما ألدريتش #P-0290 التربسين سيجما ألدريتش #T-4549 ليبوفيكتامين 3000 ثيرمو فيشر العلمي L3000-008 كاشف محسن P3000 ثيرمو فيشر العلمي L3000-008 Opti-MEM I مصل متوسط ثيرمو فيشر العلمي 31985070 كيه سي إل VWR #CABDH9258 كلوريد الصوديوم VWR #CABDH9286 NaH2PO4H2O VWR #CABDH9298 بولي د-ليسين VWR # 89134-858 DMEM Wisent # 319-005-CL FBS Wisent # 080-450