تلطيخ التألق المناعي لتصور الخلايا الجذعية العصبية المتكاثرة في أقسام دماغ الفئران

الملخص

المصدر: Quintanilla, L. J., et al. فحص التنظيم المحدد لدائرة الحصين لخلايا السلائف العصبية للحصين البالغة. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو إجراء تلطيخ الخلايا الجذعية العصبية المتكاثرة حديثا في أقسام أنسجة المخ باستخدام دمج EdU ، متبوعا بالتألق المناعي لتصور بروتينات معينة ، مما يعزز فهم ديناميكيات الخلايا والانتشار.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< p class = "jove_title" >1. الكيمياء المناعية

1. تلطيخ الثايميدين التناظري
   1. ضع أقسام الأنسجة في PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) وقم بتركيب 5-8 أقسام على شريحة موجبة الشحنة ، مع الحفاظ على الترتيب التسلسلي من الأمام إلى الخلفي ونفس الاتجاه. اترك أقسام الأنسجة تجف لتلتصق تماما بالشرائح ، ثم ارسم حدا باستخدام قلم مسعور أو قلم PAP.
   2. نفاذية الأقسام مع المخزن المؤقت للنفاذية (0.5٪ TBS (محلول ملحي مخزن مؤقتا) -تريتون) لمدة 20-30 دقيقة. ثم اغسل الأقسام 2x باستخدام TBS-triton لمدة 5 دقائق لكل منهما.
      ملاحظة: يساعد النفاذية في اختراق الأجسام المضادة داخل الخلايا. يمكن تعديل وقت النفاذية اعتمادا على سمك الأنسجة وكفاءة الجسم المضاد. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء زيادة تركيز المنظف لزيادة فاعلية النفاذية. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر حتى لا تتخلل لفترة طويلة جدا لأن هشاشة الأنسجة تزداد مع وقت النفاذية الطويل.
   3. قم بإعداد محلول تفاعل Edu (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) وفقا للجدول 1. التركيز النهائي ل Alexa488-azide هو 15 ميكرومتر في 1 مل من محلول تفاعل Edu.
   4. احتضان الأقسام في محلول تفاعل Edu لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة ثم اغسل 3x في TBS-triton لمدة 5 دقائق لكل منها. بعد هذه الخطوة ، قم بتغطية الشرائح بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء. في هذه المرحلة ، تحقق مما إذا كان تفاعل Edu يعمل باستخدام مجهر الفلورسنت. سوف تتألق الخلايا التي تحمل علامة Edu تحت مجهر epifluorescence.
2. بروتوكول قسم الأنسجة المثبتة
   1. أقسام الأنسجة المجمعة على شريحة من الخطوة 1.1.4 باستخدام المخزن المؤقت المانع الذي يتم رفعه في نفس مثل الجسم المضاد الثانوي ، على سبيل المثال ، مصل الحمير ، لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة ثم اغسل 2x في TBS-triton لمدة 5 دقائق لكل منهما.
   2. قم بإعداد محلول الجسم المضاد الأولي (أي الدجاج المضاد للنيستين) أثناء خطوة الحجب عن طريق خلط الأجسام المضادة الأولية في محلول مانع عند 1: 200. 250 ميكرولتر لكل شريحة كافية لضمان غمر الأنسجة بالكامل في المحلول.
   3. احتضان أقسام الأنسجة في محلول الجسم المضاد الأولي طوال الليل في RT بعد منع الغسيل. قم بتعديل هذه الخطوة بناء على الجسم المضاد الأساسي المستخدم.
      ملاحظه: إذا كانت الأجسام المضادة ذات خلفية عالية أو ارتباط غير محدد ، فإن الحضانة عند 4 درجات مئوية بدلا من RT (درجة حرارة الغرفة) قد تحسن النتائج. يمكن ترك الأجسام المضادة ذات اختراق الأنسجة الضعيفة للاحتضان لمدة يومين إذا لزم الأمر.
   4. احتضان أقسام الأنسجة 3x في TBS-triton لمدة 5 دقائق لإزالة الجسم المضاد الأساسي الزائد. بعد ذلك ، قم باحتضان أقسام الأنسجة في الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور (على سبيل المثال ، Alexa 647 المضاد للدجاج في الساعة 1: 200) المحضرة في محلول عازل مانع لمدة ساعتين في RT.
   5. احتضان أقسام الأنسجة 3x في TBS-triton لمدة 5 دقائق لإزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة وتطبيق محلول 300 ميكرومتر DAPI (4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole) في 1: 100 في PBS لمدة 15 دقيقة في RT.
   6. احتضان أقسام الأنسجة 3x في PBS لمدة 5 دقائق لإزالة DAPI الزائد وإزالة دائرة قلم عنق الرحم من حول الأنسجة باستخدام قطعة قطن أو مسح مهمة دقيق. اترك الأقسام تجف ، ثم قم بتطبيق وسائط التثبيت والغطاء. اترك وسائط التركيب تجف قبل شرائح التصوير.

الجدول 1: المحاليل المستخدمة في الكيمياء المناعية

محلول مضاد للتجمد إيثيلين جلايكول 150 مل + سكروز 150 جم + تعبئة إلى 500 مل 0.1 م PB لمحلول 500 مل عازلة السترات 9 مل من مخزون حامض الستريك + 41 مل من محلول سترات ثلاثي الصوديوم + 450 مل من DDH₂O مخزون حامض الستريك [0.1 م] حامض الستريك 21 جم/1 لتر DDH₂O مخزون سترات ثلاثي الصوديوم [0.1 م] سترات ثلاثية الصوديوم 29.4 جم/1 لتر DDH₂O تريس محلول ملحي مخزن -تريتون (TBS -Triton) 0.05٪ 100-x Triton في TBS المخزن المؤقت للنفاذية 0.5٪ 100-x Triton في TBS المخزن المؤقت للحجب 0.33 مل مصل الحمار في 10 مل TBS-Triton حل رد فعل Edu اصنع محلول CuSO₄ · 5 H₂O عن طريق إضافة 1 مجم من CuSO₄ · 5 H₂O في محلول 4 مل من [0.1 م] Tris pH 8.5. ثم أضف 1: 40 من محلول 600 ميكرومتر Alexa488-azide و 10 مجم / مل من L-Na + ascorbate إلى محلول CuSO₄ · 5H₂O قبل وضعه على الأنسجة.

المواد