تحديد السمية التي يسببها الجسيمات النانوية في الخلايا العصبية التي تستخدم الخلايا الدبقية الصغيرة كجهاز استشعار حيوي بديل

الملخص

المصدر: Duffy، C.M. et al.، Microglia كجهاز استشعار حيوي بديل لتحديد السمية العصبية للجسيمات النانوية.J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو طريقة لتقييم التأثيرات السامة للأعصاب للجسيمات النانوية باستخدام الخلايا الدبقية الصغيرة. يحدد خطوات تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة بالجسيمات النانوية ، وتصفية الوسائط المشروطة لعزل السيتوكينات المؤيدة للالتهابات المشتقة من الخلايا الدبقية الصغيرة ، واختبار سمية الخلايا العصبية تحت المهاد باستخدام الوسائط المكيفة.

البروتوكول

فئة

1. صيانة ثقافة الخلايا الدبقية

الصغيرة

1. وسط زراعة الخلايا الدافئة (وسط النسر المعدل من Dulbecco; DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنين (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين / نيومايسين (PSN) إلى 37 درجة مئوية.
2. احصل على مخزون مجمد من خلايا BV2 microglial عند المرور 18-25 من التخزين عند -80 درجة مئوية.
3. انقل الخلايا برفق إلى قارورة تهوية^{مقاس 75 سم 2} تحتوي على وسائط زراعة خلايا سعة 10 مل.
4. احتضان قارورة في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية. استنشق الوسائط بعد 24 ساعة واستبدلها بوسائط جديدة. تنمو الخلايا حتى حوالي 70-80٪ التقاء.

< p class = "jove_title" >2. عد الخلايا والطلاء

1. في حمام مائي 37 درجة مئوية ، محلول DMEM دافئ و 1x-trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
2. استنشق الوسائط من الخلايا وأضف 500 ميكرولتر من التربسين. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق.
3. باستخدام مكشطة ، قم بإزالة الخلايا من القارورة وعلقها في 5 مل من DMEM. مرر الخلايا عبر مصفاة 70 ميكرومتر إلى أنبوب سعة 50 مل ثلاث مرات.
4. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم وزرع 8,000 خلية / بئر في صفيحة سفلية شفافة ذات جدران سوداء في حجم نهائي قدره 200 ميكرولتر DMEM مكمل ب 10٪ FBS و 1٪ PSN. احتضان اللوحة في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
5. قم بإزالة DMEM القديم واستبدله ب 200 ميكرولتر من DMEM الدافئ المكمل ب 1٪ PSN لمصل الخلايا الدبقية الصغيرة المتجوعة. احتضان اللوحة في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

< p class = "jove_title" >3. تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة

1. في أنابيب منفصلة ، يتم تخفيف جسيمات الفضة النانوية (AgNPs) (0.01 أو 0.05 أو 0.1 ميكروغرام / مل) والتحكم في السيارة / المحايد (سترات الصوديوم ، 0.04 مل) في DMEM الخالي من المصل المكمل ب 1٪ PSN لتركيزات العمل النهائية.
2. قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسائط من كل بئر واستبدلها ب 100 ميكرولتر من مركب المعالجة المناسب.
3. احتضان اللوحة في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

< p class = "jove_title" >4. تصفية الوسائط المشروطة

1. اجمع 200 ميكرولتر من المادة الطافية للوسائط من كل بئر وانقلها إلى مرشح (قطع الوزن الجزيئي 10 كيلو دالتون) مع أنبوب تجميع (سعة 1.5 إلى 2 مل).
2. جهاز طرد مركزي عند 14,000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
3. تخلص من التدفق (طافي بالجسيمات) وضع المرشح رأسا على عقب في أنبوب تجميع جديد.
4. جهاز طرد مركزي عند 1,000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة < br / > ملاحظه: تتركز الوسائط المفلترة الناتجة (التي تحتوي على السيتوكينات المفرزة) ستة أضعاف.
5. ارفع حجم المركز إلى 400 ميكرولتر مع DMEM الطازج المكمل بنسبة 10٪ FBS و 1٪ PSN وقم بتخزينه على الثلج.

< ص الفئة = "jove_title" >5. صيانة ثقافة الخلايا تحت المهاد

1. وسط زراعة الخلايا الدافئ DMEM مكمل بنسبة 10٪ FBS و 1٪ PSN إلى 37 درجة مئوية.
2. احصل على مخزون مجمد من خلايا ما تحت المهاد (mHypo-A1 / 2) عند المرور 18-25 المخزنة عند 80 درجة مئوية. قم بإذابة الخلايا بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
3. انقل الخلايا برفق إلى قارورة تهوية^{مقاس 75 سم 2} تحتوي على وسائط زراعة خلايا سعة 10 مل.
4. احتضان قارورة في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية. استنشق الوسائط بعد 24 ساعة واستبدلها بوسائط جديدة. تنمو الخلايا حتى تصل إلى حوالي 70-80٪ من التقاء.

< ص الفئة = "jove_title">6. تحديد سمية الخلايا تحت المهاد

1. دافئ DMEM و 1x-trypsin-EDTA في حمام مائي 37 درجة مئوية.
2. استنشق الوسائط من خلايا ما تحت المهاد وأضف 500 ميكرولتر من التربسين. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق. قم بإزالة الخلايا من القارورة باستخدام مكشطة ، كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2.
3. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم وخلايا ما تحت المهاد في 5,000 خلية / بئر في صفيحة سفلية شفافة ذات جدران سوداء في حجم نهائي قدره 200 ميكرولتر DMEM مكمل بنسبة 10٪ FBS و 1٪ PSN ، واحتضانها بين عشية وضحاها في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية.
4. قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسائط القديمة باستخدام ماصة متعددة القنوات وأضف 100 ميكرولتر من الوسائط المكيفة المركزة المفلترة إلى التركيز النهائي البالغ 1x.
5. احتضان اللوحة في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
6. أضف 22 ميكرولتر من كاشف الريزازورين واحتضان اللوحة لمدة 20 دقيقة في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية.
7. باستخدام مقياس الطيف الضوئي متعدد الأوضاع ، سجل التألق (560 نانومتر EX / 590 نانومتر EM) لقياس صلاحية الخلية. تقرير النتائج كوحدات مضان نسبية (RFU).

المواد