إصابة ذبابة الفاكهة الأعصاب القطعية الجزئية ميكانيكيا للحث على التنكس العصبي

الملخص

المصدر: Danella ، E. B. ، et al. منهجية بسيطة للإصابة الميكانيكية العصبية لدراسة تنكس الخلايا العصبية الحركية ذبابة الفاكهة. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح الفيديو إحداث التنكس العصبي في ذبابة الفاكهة الأعصاب المقطعية عن طريق الإصابة الميكانيكية. يتم ضغط البشرة البطنية لليرقات المخدرة باستخدام ملقط لإحداث إصابة الأعصاب المقطعية. يتم الحفاظ على اليرقات المصابة بالطعام ، مما يسمح للإصابة بالتسبب في تنكس الخلايا العصبية الحركية في الأعصاب ، مما يتسبب في تعطيل توصيلها العصبية العضلية (NMJs).

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الكواشف والمعدات

1. تحضير 1x مخزن مؤقت للتشريح (70 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي كلوريد كلوريد ، 0.02 ملي كلوريد_{الملليوم 2} ، 20 ملي مللي كلوريد_{الملجم 2} ، 10 ملي هيدروكسي هيدروكسيد الصوديوم₃ ، 115 ملي سكروز ، 5 ملي تريهالوز ، 5 ملي هيدروكسي إيثيل بيبرازين حمض السلفونيك [HEPES] ؛ الرقم الهيدروجيني 7.2).
2. تحضير 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
3. قم بإعداد 1x PBT باستخدام 1x PBS مع 0.01٪ Triton X-100.
4. تحضير أطباق أجار عصير الفاكهة.14 باختصار ، اخلطي 30 جم أجار في 700 مل من H₂O والأوتوكلاف. قم بإذابة 0.5 جم من ميثيل بارابين في 10 مل من الإيثانول وأضف المحلول إلى 300 مل من مركز عصير الفاكهة (العنب أو التفاح). يمزج المركز في محلول أجار معقم ويسكب في أغطية أطباق بتري مقاس 10 مم × 35 مم.
   ملاحظه: يمكن أيضا شراء بريمكس طاقة أجار العنب من شركات مختلفة (انظر جدول المواد).
5. احصل على ملقط بحجم 5 يسمح للمرء بإصابة اليرقات ميكانيكيا.
6. استخدم جهاز التخدير القياسي ذبابة الفاكهة_{CO 2}.

2. اختيار ذبابة الفاكهة يرقات

1. خذ قارورة أو زجاجة ذبابة الفاكهة تحتوي على يرقات الطور الثالث المتجولة التي تم استزراعها عند 25 درجة مئوية.
2. حدد عشرة يرقات فردية 2 أو 3 في الطور بناء على المظهر. يمكن التعرف على يرقات الطور الثالث من خلال ظهور الفتحات التنفسية المتفرعة الأمامية ، في حين أن يرقات الطور الثاني أصغر حجما ولديها المزيد من الفتحات التنفسية الأمامية الشبيهة بالمضرب.
   ملاحظه: يمكن أيضا تحديد مراحل اليرقات حسب التوقيت. عند 25 درجة مئوية ، تظهر يرقات الطور الثاني بعد حوالي 48 ساعة من الفقس ، وتذوب يرقات الطور الثالث بعد حوالي 24 ساعة. إذا كنت مهتما بفحص التنكس العصبي في NMJ ، فيجب إصابة يرقات الطور الثاني.

فئة

3. تحضير يرقات ذبابة الفاكهة للإصابة الميكانيكية

1. اختر اليرقات الفردية بعناية باستخدام ملقط أو فرشاة رسم ، مع الحرص على عدم ضغطها بأي شكل من الأشكال.
2. ضع عشر يرقات مباشرة في طبق زجاجي يحتوي على 1X PBS بارد أو مخزن مؤقت للتشريح لإزالة أي بقايا طعام وإبطاء حركة اليرقات.

فئة

4. الإصابة الميكانيكية وعلاج يرقات ذبابة الفاكهة

1. ضع كل يرقة على جهاز تخدير ثاني أكسيد الكربون₂.
2. تحت مجهر تشريح ، قم بلف كل يرقة بعناية على جانبها الظهري من أجل تصور الأعصاب القطاعية من خلال البشرة.
3. حجم الموضع 5 ملقط تقريبا 1/2 إلى 2/3 الطريق أسفل طول اليرقة بدءا من خطافات الفم. بمجرد وضعه ، اضغط على ما يقرب من 1/3 من البشرة البطنية التي تحتوي على الأعصاب المقطعية بحجم 5 ملقط.
   1. لضمان إصابة الأعصاب المقطعية اليرقية ، استخدم قوة كافية لسحق الأعصاب المقطعية ولكن اترك البشرة سليمة. لتحديد المقدار الصحيح للقوة ، سحق 10 يرقات وتأكد من أن معدل الوفيات بعد 5 ساعات أقل من 50٪.
4. بعد الإصابة ، انقل اليرقات بحذر إلى طبق أجار عصير الفاكهة الذي يحتوي على حوالي 0.5 غرام من معجون الخميرة. ضع كل يرقة بحيث تكون نهايتها الأمامية على عجينة الخميرة ، لاستمرار التغذية على الرغم من اضطراب الحركة.
   ملاحظه: للتأكد من إصابة الأعصاب القطاعية اليرقية ، يمكن ملاحظة حركة اليرقات المتقطعة بعد نقلها إلى صفيحة أجار. اليرقات المصابة مشلولة بشكل فعال خلف موقع الإصابة ، ولكن لا يزال بإمكانها تحريك خطافات الفم والتغذية. يعد ارتفاع معدل نفوق بعد الإصابة أمرا شائعا ، لذلك من الأفضل إصابة بنسبة 20-50٪ أكثر مما هو ضروري للتجربة.
5. ضع أطباق أجار تحتوي على عجينة الخميرة و 10 يرقات مصابة في قاع طبق بتري فارغ مقاس 100 × 15 مم. قم بتغطية صفيحة بتري هذه ، التي تحتوي الآن على اليرقات المصابة على صفيحة أجار بمنشفة ورقية مبللة ، مع التأكد من أن المنشفة الورقية لا تلمس اليرقات أو ألواح الأجار. ضع طبق بتري هذا في وعاء أكبر محكم الغلق ، في درجة حرارة الغرفة (RT).
6. استرجاع اليرقات للتشريح بعد فترات محددة (6 أو 12 أو 24 ساعة) بعد الإصابة.
   ملاحظه: لفحص الآثار الفورية للإصابة على الهيكل الخلوي المحوري ، يمكن تشريح اليرقات مباشرة بعد الإصابة. لفحص عيوب النقل المحوري ، يمكن تشريح اليرقات بعد حوالي 6 ساعات من الإصابة. بعد حوالي 12 ساعة من الإصابة ، يمكن ملاحظة تراكم البروتينات في كل مكان ، وبعد 24 ساعة من الإصابة ، يمكن ملاحظة تنكس الخلايا العصبية الحركية في NMJ.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مقص التشريح الدقيق أدوات العلوم الدقيقة 15000-08 دومون # 3 ملقط أدوات العلوم الدقيقة 11231-30 يفضل بعض الناس المقاس 3 ، بينما يفضل البعض الآخر الحجم 5 دومون # 5 ملقط أدوات العلوم الدقيقة 11251-30 يفضل بعض الناس المقاس 3 ، بينما يفضل البعض الآخر الحجم 5 خزان الهواء_{CO 2} تك اير رقم الأمم المتحدة 1013 يمكن شراء أحجام مختلفة من الخزانات جهاز التخدير CO₂ S جينيسي العلمي 59-114 دبابيس ستانلس ستيل، مقاس 0.1 أدوات العلوم الدقيقة 26002-10 SylGard 184 سيليكون المطاط الصناعي ، القاعدة وعامل المعالجة داو كورنينج 3097358-1004 لصب لوحات التشريح تشريح ستيريو ميكروسكوبي أمسكوب SM-1BZ مصدر الضوء أمسكوب HL150-AY-220V فلاي ستاف عصير العنب أجار بريمكس جينيسي العلمية 47-102 شرائح المجهر جينيسي العلمية 29-101 أغطية زجاجية فيشر ساينتيك 12-545-87 صندوق المرافق Thermo Scientific Nalgene فيشر ساينتيك 03-484 ج تستخدم لإنشاء غرفة رطبة لاستعادة اليرقات