تلطيخ مناعي الأنسجة القحفية الوجهية للفأر

الملخص

المصدر: Yang، J.، et al.، تحضير الأنسجة والتلوين المناعي للأنسجة القحفية الوجهية للفأر والعظام غير المتكلسة. J. Vis. إكسب. (2019)

يوضح هذا الفيديو تلطيخ التألق المناعي للعمليات البردية من الأنسجة القحفية الوجهية الجنينية للفأر ، باستخدام الفحص المجهري الفلوري لتقييم تعبير العلامات النووية وتحديد تكاثر الخلايا ونشاط الإشارات.

البروتوكول

نص إخلاء المسؤولية: تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية للحيوانات المناسبة.

فئة

1. تلطيخ التألق المناعي

1. أخرج الشرائح من -80 درجة مئوية. احتفظ بالشرائح في RT لمدة 1 ساعة لتجفيف الأقسام. اشطف الشرائح في 0.1٪ PBST (0.1٪ بولي إيثيلين جلايكول ثلاثي أوكتيل فينيل إيثر في PBS ؛ انظر جدول المواد) ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها لغسل OCT واختراق الأقسام.
2. اختياريا ، قم بإجراء استرجاع المستضد (اختياري).
   1. سخن عازلة السترات (10 ملي مولار سترات الصوديوم درجة الحموضة 6) في طبق التلوين باستخدام قدر بخاري أو حمام مائي إلى 95-100 درجة مئوية. اغمر الشرائح في عازلة السترات واحتضانها لمدة 10 دقائق.
   2. أخرج طبق التلوين من قدر البخار أو الحمام المائي وقم بتبريد الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة أو أكثر15.
      ملاحظه: كبدائل ، استخدم المخزن المؤقت Tris-EDTA (10 ملي ملي قاعدة تريس ، 1 ملي مولار EDTA ، 0.05٪ توين 20 ، درجة الحموضة 9.0) أو المخزن المؤقت EDTA (1 ملي مولار EDTA ، 0.05٪ توين 20 ، درجة الحموضة 8.0) لاسترجاع المستضد الناجم عن الحرارة. استخدم قدر الضغط أو الميكروويف أو الحمام المائي لاسترجاع المستضد الناجم عن الحرارة بالإضافة إلى القدر البخاري الساخن. يعد استرجاع المستضد الناجم عن الإنزيم باستخدام التربسين أو البيبسين بديلا آخر. تحسين التركيز ووقت العلاج للاسترجاع الأنزيمي لتجنب إتلاف الأقسام. تحسين طريقة استرجاع المستضد لكل مجموعة من الأجسام المضادة / المستضد.
3. احتضن كل شريحة ب 200 ميكرولتر من محلول المانع (مصل حمار 5٪ مخفف بنسبة 0.1٪ PBST) عند RT لمدة 30 دقيقة ، ثم قم بإزالة محلول المانع دون شطفه.
4. احتضان كل شريحة ب 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية أو الأجسام المضادة المخففة في محلول مانع لمدة ساعة واحدة عند RT أو O / N عند 4 درجات مئوية. اشطف الشرائح باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في RT.
5. احتضن كل شريحة ب 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف في محلول مانع لمدة 1 ساعة في RT. اشطف الشرائح في PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في RT. حماية الشرائح من الضوء.
6. جبل الشرائح.
   1. أضف قطرتين من الوسط المضاد للبهتان مع DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole) على الشريحة. ثم قم بتغطيتها بغطاء.
   2. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام حتى يصبح جاهزا للتصوير.
      ملاحظه: كبديل ، قم بتسمية النوى بصبغة DAPI أو Hoechst 33324 المخففة 1: 2,000 في PBS عند RT أولا ، ثم قم بتركيبها بالجلسرين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أليكسا فلور 488 الماعز المضاد للأرانب الجسم المضاد الثانوي إنفيتروجين أ -11034 حامل مضاد للبهتان مع DAPI إنفيتروجين ص36931 ألبومين مصل الأبقار سيغما أ 2153 أغطية فيشر براند 12-545-ه كرايوستات لايكا سم 1850 EDTA سيغما E6758 المجهر الفلوري أوليمبوس BX51 شرائح المجهر فيشر براند 12-550-15 كمبوند OCT فيشر للرعاية الصحية 23-730-571 بارافورمالدهايد (PFA) سيغما ص 6148 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) سيغما ص 4417 البولي إيثيلين جلايكول ثلاثي أوكتيل الفينيل الأثير سيغما تي 9284 تريتون X-100 الأرنب المضاد للجسم المضاد Ki67 تقنية إشارات الخلية 9129 الكثير #:3; RRID:AB_2687446 الأرانب المضادة للجسم المضاد pSmad1 / 5/9 تقنية إشارات الخلية 13820 [ا] الكثير #:3; RRID:AB_2493181 سترات الصوديوم سيغما 1613859 تريس سيغما 10708976001